粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了p ET-28a(+)-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6×His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。     

小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]表达、纯化小鼠Prune蛋白DHH结构域(m-Prune D),并制备多克隆抗体。[方法]生物信息学方法分析m-Prune D氨基酸序列;PCR扩增目的基因m-Prune D,克隆入原核表达载体p ET28a(+);IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白表达,亲和层析法纯化蛋白;用纯化的重组m-Prune D免疫小鼠制备多克隆抗体;Western Blot检测多克隆抗体特异性。[结果]PCR成功扩增m-Prune D基因,双酶切及测序结果表明成功构建m-Prune D原核表达载体,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明成功表达约25 k Da的重组蛋白。纯化蛋白免疫小鼠后抗体滴度最高可达1∶25 600,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核和真核细胞中DHH结构域蛋白。[结论]在E.coli中成功表达小鼠Prune蛋白DHH结构域,制备了多克隆抗体血清,可用于Prune蛋白生物学功能的进一步研究。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

果蝇Domeless蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

在果蝇(Drosophila melanogaster)的研究中发现Domeless接受器参与发育期间的JAK/STAT信号调节,在心脏疾病的发生机制中发挥重要作用.为了克隆Domeless,我们利用生物信息学选择果蝇Domeless基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E.coli(Escherichia coli)中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-Domeless融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western blot检测抗体的效价和特异性.获得了Domeless原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Domeless多克隆抗体,为后续Domeless功能研究奠定了基础.     

猪FcγRⅢ的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建猪FcγRIII基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪FcγRIII抗血清。方法:从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII原核表达载体pET-FcγRIII,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清,ELISA结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果:成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论:成功获得了猪FcγRIII多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII蛋白的功能奠定了基础。     

Ataxin-3融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的:表达GST-ataxin-3-N融合蛋白并制备GST-ataxin-3特异性抗体,为深入研究其功能及其在SCA3发病机制中的作用提供重要的技术和材料保障.方法:将人ataxin-3氨基端基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,在大肠杆菌(E.coli)BL21中表达,用Glutathione sepharose4B凝胶亲和柱纯化目的蛋白.利用纯化的GST-ataxin-3-N蛋白制备多克隆抗体.结果:成功构建了原核表达载体,得到高表达量的融合蛋白,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-ataxin-3-N融合蛋白.以融合蛋白免疫新西兰兔得到Ataxin-3-N多克隆抗体,Western Blotting及免疫荧光均证实该抗体能够识别Ataxin-3-myc蛋白,具有较高特异性.结论:利用原核表达人GST-ataxin-3-N融合蛋白制备的Ataxin-3多克隆抗体具有较好的特异性,可用于该蛋白的相关研究.     

DC-SIGN胞外区基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

旨在构建DC-SIGN胞外区基因原核表达质粒,诱导蛋白表达并制备多克隆抗体。用PCR的方法扩增编码DC-SIGN胞外区的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,利用大肠杆菌表达系统表达DC-SIGN胞外区蛋白,用H is抗体做W estern Blotting鉴定目的蛋白的免疫原性。用纯化的DC-SIGN胞外区蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,免疫荧光法检测其特异性。结果显示,原核表达载体pET-28 a(+)-DC-SIGN胞外区基因成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,获得相对分子质量约20 kD的DC-SIGN胞外区蛋白,经Westernb lotting鉴定为正确。纯化后的蛋白免疫大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫原性和特异性。本研究得到了纯化的DC-SIGN胞外区蛋白,并制备了具有特异性和高效价的抗体,为研究DC-SIGN生物学功能提供试验基础。     

家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体的制备及其检测

制备家蚕GAPDH内参蛋白多克隆抗体,并对该抗体进行检测。利用PCR技术从家蚕中克隆GAPDH基因,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白并纯化。纯化后的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备GAPDH多克隆抗体。用酶联免疫吸附法和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功构建GAPDH/p ET-28a原核表达载体,获得高纯度的GAPDH重组融合蛋白;经SDS-PAGE和抗His单抗检测,纯化后蛋白的分子量大小与预测的一致;以该蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对新西兰大白兔进行免疫,获得GAPDH多克隆抗体血清。酶联免疫吸附检测结果表明,GAPDH抗体的效价为1:8000,并能与天然家蚕蛋白特异性结合。成功制备了家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体,为深入研究家蚕中不同蛋白的生理功能和作用奠定了坚实的基础。     

美洲大蠊i型溶菌酶的原核表达及多克隆抗体制备

旨在获得美洲大蠊i型溶菌酶Pa I的原核表达蛋白,并制备鼠抗Pa I多克隆抗体。PCR扩增Pa I成熟肽编码序列,构建原核表达载体p ET28a-Pa I,诱导表达、纯化Pa I-His融合蛋白,免疫Balb/c小鼠,间接ELISA法检测抗血清效价,Western blotting检测多克隆抗体的特异性。结果显示,Pa I成熟肽部分的编码序列长414 bp,由137个氨基酸组成。构建的原核表达载体p ET28a-Pa I在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,SDS-PAGE检测显示纯化的Pa I-His融合蛋白的大小约为18 k D,间接ELISA和Western blotting分析表明免疫小鼠产生的抗血清具有较高的效价和较强的特异性。美洲大蠊溶菌酶Pa I成功实现原核表达,并获得了高效价特异性多克隆抗体。     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

家蚕核型多角体病毒蛋白组份检测方法建立

研制了兔抗家蚕核型多角体病毒蛋白组份的多克隆抗体,用间接法建立了家蚕核型多角体病毒蛋白的dot-ELISA检测方法。此法检测多角体病毒蛋白的灵敏度达10ng,与人血清和兔血清无交叉反应,可用于家蚕生物反应器生产的目的蛋白中多角体病毒蛋白组份的检测。     

重组鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白的抗原性研究

构建了鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白的原核表达载体,并对其进行了诱导表达,经过纯化,复性,获得了重组蛋白。用Westen-blotting和胶体金方法检测,此蛋白具有衣原体的免疫原性。经兔免疫接种实验,获得了多抗血清,用ELISA方法检测,其抗体滴度为1：2000。     

An antibody that binds a neutrophil membrane protein, ERp72, primes human neutrophils for enhanced oxidative metabolism in response to formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine. Implications for ERp72 in the signal transduction pathway for neutrophil priming.

Human neutrophils are primed by cytokines for enhanced oxidative metabolism in response to chemotactic factors, but the signal transduction pathways for cytokine activation and priming are unknown. Neutrophil priming may play an important role in mechanisms of host defense and inflammatory responses associated with autoimmune diseases. A rabbit antibody was produced that reacted with human neutrophils and induced priming in response to the chemoattractant, FMLP. The protein responsible for neutrophil priming in response to binding antibody was identified in a neutrophil cDNA library by expression cloning. The cloned protein absorbed the neutrophil-priming activity from rabbit serum. Furthermore, antibody priming activity was recovered by elution from the cloned protein. The gene for the protein associated with neutrophil priming was sequenced and identified as the endoplasmic reticulum protein, ERp72, which contains three copies of the active site sequences of protein disulfide isomerase. The antibody that primed neutrophils was shown to bind ERp72 in neutrophil membranes by immunoprecipitation of the same 72-kDa protein from neutrophils as a known antibody to ERp72. These studies implicate ERp72 in the signal transduction pathway for priming human neutrophils.     

中国白兔白介素-10基因的克隆、表达及其抗体的制备

目的克隆并表达中国白兔IL-10基因,制备抗IL-10多克隆抗体。方法运用RT-PCR对从ConA诱导后的中国白兔外周血单核细胞(PMBCr)总RNA中扩增IL-10基因,克隆后进行测序和遗传进化分析,同时将其亚克隆pET28a中,在大肠杆菌中诱导表达,并用纯化的表达产物制备多克隆抗体。结果该基因全长537 bp,编码178个氨基酸。与欧洲兔IL-10基因同源性很高,但与鼠、鸡、河豚和斑马鱼等不同物种IL-10基因差异较大。经IPTG诱导后,重组菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量为23.4×103的重组蛋白。Western blot分析表明,中国白兔IL-10基因已经表达。重组表达的蛋白量可占菌体蛋白的15.2%。结论成功实现了中国白兔IL-10的原核表达,制备了小鼠抗兔IL-10的多克隆抗体。     

青杄FKBP12基因原核表达和多克隆抗体的制备

目的:制备青杄FKBP12基因的多克隆抗体,为进一步分析FKBP12的蛋白定位、表达等提供基础。方法:采用PCR方法扩增FKBP12基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,转化入BL21菌株。经IPTG诱导,表达了分子量约为33kD的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。此蛋白经亲和纯化后,作为抗原注射新西兰兔,进行抗体制备。结果:成功获取了多克隆抗体,制备的FKBP12兔抗血清效价在1∶729 000以上,ELISA结果表明融合蛋白具良好的免疫原性。间接ELISA法检测纯化后抗体效价,表明纯化后抗FKBP蛋白兔多克隆抗体效价高,检测灵敏度为16ng/mL。结论:所制备的抗体能满足后续试验要求的效价值,为进一步研究提供基础。     

人源核受体hLRH-1 的表达纯化及多克隆抗体制备

目的：制备抗人源核受体hLRH-1 的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法：构建含有hLRH-1基因全长克隆的 原核表达载体pET507a-hLRH-1 并用IPTG 诱导其在Rosseta2 菌株中表达重组蛋白His-hLRH-1,经亲和层析纯化后按常规方法 免疫新西兰兔制备多克隆抗体,并用Western Blot 对其特异性进行鉴定。结果：原核表达载体pET507a-hLRH-1经测序证实构建 成功,将其转化大肠杆菌Rosseta2菌株后成功诱导表达重组蛋白His-hLRH-1,经纯化免疫新西兰兔后得到抗hLRH-1 多克隆抗 体,Western blot 证实抗体具有高度特异性。结论：成功表达His-hLRH-1 重组蛋白并制备出多克隆抗体,为进一步用于hLRH-1 的 免疫学检测及其功能研究奠定了基础。     

重组人FS315C末端蛋白表达及其抗体制备

构建FS315C末端肽原核表达载体pGEX-FS315C,表达重组人卵泡抑素315(FS315)C末端肽,制备抗FS315C末端抗体。实验结果显示,重组pGEX-FS315C表达质粒在E.coli BL21中高表达GST-FS315C融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化GST-FS315C免疫家兔,获得抗FS315C末端抗体,Western blot检测显示该抗体只与FS315结合,而与FS288无交叉反应。ELISA检测显示抗FS315C末端抗体与FS315特异结合,而与FS288、inhibin及activin A等蛋白均无交叉反应。利用该抗体进行的免疫组化染色显示巨噬细胞FS表达阳性,与以往报道一致。实验采用重组GST-FS315C免疫家兔,成功地制备了抗FS315C末端特异抗体。     

登革2型病毒E蛋白结构域III的表达及多克隆抗体制备

登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV-1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病[1,2]。E蛋白是位于DENV表面的结构蛋白,由495个氨基酸组成,它既含有黄病毒亚群特异的和登革病毒血清型特异的抗原表位,又有与中和,血凝抑制作用有关的抗原表位,是病毒颗粒的主要包膜蛋白[3]。Modis等研究表明,DENV-2型E蛋白以延伸的二聚体形式平铺在病毒表面,折叠成3个不…