RNAi介导的GdHsp60和GdHsp70基因沉默对沙葱萤叶甲幼虫抗寒性的影响

【目的】本研究旨在比较不同RNAi方法对沙葱萤叶甲Galeruca daurica幼虫热激蛋白基因(GdHsp60和GdHsp70)的沉默效率,以选择一种可高效降低靶基因表达水平的研究方法,明确这两个热激蛋白在沙葱萤叶甲幼虫抗寒性中的作用。【方法】分别通过饲喂法和显微注射法进行RNAi沉默沙葱萤叶甲1和2龄幼虫的GdHsp60和GdHsp70,采用qPCR检测GdHsp60和GdHsp70的沉默效率;通过显微注射法分别 对GdHsp60和GdHsp70进行RNAi后24 h,用热电偶法测定沙葱萤叶甲2龄幼虫过冷却点和结冰点,生物测定沙葱萤叶甲2龄幼虫暴露于不同低温条件下(-6~-14℃) 2 h的半致死温度(Ltemp₅₀)以及在-5℃低温条件下处理不同时间后的半致死时间(Ltime₅₀)。【结果】用饲喂法和显微注射法进行RNAi均可以降低GdHsp60和GdHsp70的表达水平,但显微注射法的沉默效率更高。与对照组(显微注射dsGFP)相比,沙葱萤叶甲2龄幼虫分别显微注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后,GdHsp60和GdHsp70的表达水平均降至最低,分别降低了84.15%和92.38%。在沙葱萤叶甲2龄幼虫中,显微注射dsGdHsp60 24 h后其过冷却点、结冰点、Ltemp₅₀及Ltime₅₀值分别-10.56±0.42℃,-7.66±0.56℃,-8.33℃和49.25 h,显微注射dsGdHsp70 24 h后其过冷却点、结冰点、Ltemp₅₀及Ltime₅₀值分别为-9.08±0.23℃,-6.09±0.28℃, -8.20℃和52.21 h,而对照组的分别为-14.71±0.11℃,-13.94±0.09℃,-10.63℃和87.13 h。与对 照组(显微注射dsGFP)相比,在沙葱萤叶甲2龄幼虫分别显微注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后过冷却点 、结冰点和Ltemp₅₀显著上升,而Ltime50值显著缩短。【结论】显微注射法可作为沙葱萤叶甲Hsp相关基 因RNAi的主要干扰方法;沉默GdHsp60和GdHsp70基因均会显著降低了沙葱萤叶甲幼虫的抗寒能力。     

Ezrin多克隆抗体制作及应用

构建Ezrin原核重组表达载体pET-28a(+)-ezrin,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导获得Ezrin蛋白,将经镍柱亲和层析纯化后的蛋白分别免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠(KM),获得抗血清,采用ELISA和Western blotting,免疫荧光测定其效价和特异性。ELISA对抗血清进行效价测定表明抗血清可与抗原发生特异性免疫反应;通过Western blotting对抗血清进行鉴定表明抗血清可以识别几种细胞株内的特异性条带,其相对分子量为82 kD,与预测分子量相符;免疫荧光试验表明抗血清可以识别细胞内的Ezrin蛋白,且定位情况与文献报道相符。最后通过protein G对抗血清进行了纯化。结果表明用该方法制备的Ezrin多克隆抗体有较高的特异性和灵敏度。     

Ezrin蛋白信号转导通路及其对肿瘤侵袭转移的最新进展

肿瘤转移是一个多阶段、多途径、涉及多基因及其信号通路变化的一系列复杂过程。了解肿瘤转移相关基因的信号传导通路以及对肿瘤转移的作用机制,为寻找抑制肿瘤转移的关键靶点具有重要的意义。Ezrin高表达与肿瘤转移密切相关,它可通过改变肿瘤细胞极性及细胞运动、调节肿瘤细胞间黏附及细胞与细胞外基质黏附、参与肿瘤细胞内信号转导而影响恶性肿瘤转移。Ezrin过度表达可以破坏正常细胞内信号传递网络的平衡,其中主要涉及的为细胞信号转导相关分子(Rho)及受体酪氨酸蛋白激酶等信号传导途径。Ezrin借助于细胞内错综复杂的信号转导网络调控细胞的形态构成、黏附、吞噬、运动、血管形成等一系列的生物学过程,最终实现肿瘤细胞的侵袭和转移。本文就Ezrin蛋白的信号转导通路及其对肿瘤转移作用的研究进展做一综述。     

牧草盲蝽CYP6A13和钠离子通道LPVSSC基因的克隆及参与高效氯氟氰菊酯的抗性分析

昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性主要是解毒酶活性的增强和钠离子通道的敏感度降低所致。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了牧草盲蝽Lygus pratensis P450 CYP6A13基因（GenBank登录号：MN782520）及钠离子通道LPVSSC基因cDNA全长序列（GenBank登录号：MW821485）。其中CYP6A13基因全长2 003 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子质量为57.2 kDa,主要位于细胞内质网,等电点为5.77,无跨膜区和信号肽,存在血红素结合保守功能区。同源比对与系统进化分析表明,牧草盲蝽的CYP6A13与分类学关系上较为接近的昆虫同源蛋白间高度相似。钠离子通道序列LPVSSC开放阅读框6 072 bp,编码2 024个氨基酸,预测蛋白分子质量为228.94 kDa,等电点为4.99,无信号肽,有多个跨膜区域,4个同源结构域（I~IV）,每个结构域有6个跨膜片段（S1~S6）,存在MFM基序。基因表达谱结果表明：CYP6A13在牧草盲蝽成虫头部的表达量高于胸、腹部;室内筛选的高效氯氟氰菊酯抗性R14、R6品系的CYP6A13表达量是敏感品系的18.74和5.45倍;CYP6A13表达量在雌、雄成虫之间无显著差异;不同发育期基因表达量为：初羽化成虫>5龄若虫>4龄若虫>3龄若虫>2龄若虫>1龄若虫。测序比对高效氯氟氰菊酯抗性与敏感品系的钠离子通道序列IIS4~IIS6区域,未发现存在可能导致靶标抗性的氨基酸突变。结果表明CYP6A13基因过表达可能导致了牧草盲蝽对高效氯氟氰菊酯的抗药性,为深入解析CYP6A13基因介导抗药性的功能研究奠定基础。     

壳聚糖介导CrmA基因治疗小鼠肝纤维化的研究

目的：探讨壳聚糖介导的CrmA对小鼠肝纤维化的治疗效果,以期为肝纤维化的基因治疗提供实验基础。方法：清洁级的75只雄性小鼠随机分为正常组、模型组、壳聚糖介导的CrmA组、壳聚糖介导的空载体组、壳聚糖组,每组15只。应用30％四氯化碳橄榄油溶液3ml／kg腹腔注射制备肝纤维化小鼠模型。治疗8周后,眼眶取血,检测血清的肝功能指标,并取肝组织做HE染色,观察各组小鼠肝脏的病理形态,Real TimePCR检测肝组织IL-1β、α-SMA、TGF—β1、TIMP-1表达量。结果：与模型组小鼠相比,壳聚糖介导的CrmA组小鼠的肝纤维化程度减轻,ALT、AST显著降低（P〈0．01）,肝组织IL-1β、α-SMA、TIMP1、TGF-β1的表达明显减少（P〈0．05）,而模型组、壳聚糖介导的空载体组和壳聚糖组均无显著性差异。结论：壳聚糖介导的CrmA能有效减轻肝纤维化小鼠的肝脏损伤和纤维化程度,为基因治疗肝纤维化提供了一种潜在的新思路和方法。     

肠道微生物代谢物在肝硬化中的作用CSCD

肝硬化是由多因素引起的终末期肝病,也是导致慢性肝病患者病死的主要原因之一。随着微生物相关多组学的发展和应用,越来越多的研究发现,肠道微生物及其代谢产物如短链脂肪酸、胆汁酸和内毒素等在肝硬化等肝脏疾病中发挥主要作用,但这些肠道微生物代谢产物影响肝硬化发展的机制依然不明确。因此,根据近年来关于肠道微生物及其代谢产物与肝硬化关系的研究,本文重点介绍几种研究比较深入的微生物代谢物以及其影响肝硬化发展的潜在的作用机制,并简要介绍微生物代谢物治疗肝硬化的方法,以期为肝硬化的病理生理学机制、诊断和治疗提供新的见解。     

壳聚糖介导CrmA基因治疗小鼠肝纤维化的研究

目的:探讨壳聚糖介导的CrmA对小鼠肝纤维化的治疗效果,以期为肝纤维化的基因治疗提供实验基础。方法:清洁级的75只雄性小鼠随机分为正常组、模型组、壳聚糖介导的CrmA组、壳聚糖介导的空载体组、壳聚糖组,每组15只。应用30%四氯化碳橄榄油溶液3 ml/kg腹腔注射制备肝纤维化小鼠模型。治疗8周后,眼眶取血,检测血清的肝功能指标,并取肝组织做HE染色,观察各组小鼠肝脏的病理形态,Real Time PCR检测肝组织IL-1β、α-SMA、TGF-β1、TIMP-1表达量。结果:与模型组小鼠相比,壳聚糖介导的CrmA组小鼠的肝纤维化程度减轻,ALT、AST显著降低(P0.01),肝组织IL-1β、α-SMA、TIMP1、TGF-β1的表达明显减少(P0.05),而模型组、壳聚糖介导的空载体组和壳聚糖组均无显著性差异。结论:壳聚糖介导的CrmA能有效减轻肝纤维化小鼠的肝脏损伤和纤维化程度,为基因治疗肝纤维化提供了一种潜在的新思路和方法。