小麦种子过氧化物酶WP1 基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

WP1是小麦种子中最主要的阳离子过氧化物酶,该酶不仅参与种子的发育过程,而且影响面粉的加工品质。首先构建了WP1基因原核表达载体pET28a-WP1,并将其转化到T7 Expression大肠杆菌菌株中诱导表达。His-tag融合的WP1主要以包涵体形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化,获得纯度大于98％的重组蛋白。重组WP1经尿素梯度透析复性溶解后免疫新西兰大白兔,最终获得WP1多克隆抗体。ELISA分析结果显示制备的WP1兔抗血清的效价大于1∶625 000;Western blotting结果证明制备的多克隆抗体对WP1具有很好的专一性。     

UASB-化学混凝技术处理草浆造纸废水的研究

采用UASB-化学混凝技术组合对草浆造纸废水进行处理。结果表明,接种颗粒污泥的二级启动,大大缩短了反应器的启动时间。在水力停留时间(HRT)6 h,进水COD逐渐提高的情况下对颗粒污泥进行驯化,20 d后pH、COD去除率趋于稳定。另外,通过L9(34)正交试验,研究了混凝中4因子影响大小的排序,并在最优条件下对UASB反应器出水进行混凝处理。组合技术处理的出水水质指标符合国家造纸工业污水排放标准。     

产甲烷菌研究进展

产甲烷菌是重要的环境微生物,在自然界的碳素循环中起重要作用。迄今已有5种产甲烷菌基因组测序完成。基因组信息使人们对产甲烷茵的细胞结构、进化、代谢及环境适应性有了更深的理解。目前已知的甲烷生物合成途径有3种,它们以乙酸、甲基化合物、氢/二氧化碳为起始,通过不同的反应途径都形成了甲基辅酶M,在甲基辅酶M还原酶的催化下最终形成甲烷。     

大豆类黄酮生物合成关键酶CHS基因的克隆及表达分析

根据查尔酮合成酶(CHS)基因DNA序列的保守区域设计了PCR引物,通过RT-PCR扩增从大豆叶片中克隆出3个参与类黄酮合成的CHS基因,分别命名为GmCHS1、GmCHS2和GmCHS3。在大豆基因组数据库进行同源比对,发现这3个基因分别与大豆基因组上Gm08g11610、Gm05g28610和Gm08g11520相对应,DNA序列一致性达95%～98%,推导氨基酸序列一致性达98%以上。进化分析显示,大豆中3个CHS蛋白与决明、菜豆CHS蛋白亲缘关系较近。表达分析显示,这3个基因在不同品种间有表达水平的差异,这可能是不同大豆品种中类黄酮含量不同的重要原因之一。     

单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究

T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和His-tag融合的两种T7EⅠ突变体,MBP-T7EⅠ(E20K)和His6-T7EⅠ(E65K).每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性,通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化,最终获得具有单个活性结构域的T7EⅠ异源二聚体(T7EⅠ-SAD).以pUC(AT)和pUC19为底物测试T7EⅠ-SAD的HJ拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性,结果显示,T7EⅠ-SAD可特异识别并切刻HJ结构,但丧失了同时引入两个切刻位点的能力,其对pUC(AT)的特异切刻活力和对pUC19的随机切刻活力与野生酶相当.逐级变性梯度洗脱实验显示,T7EⅠ-SAD的稳定性与野生型酶接近,二聚体解离需要5.0～6.0mol/L尿素或1.75～2.0mol/L盐酸胍;凝胶阻滞实验表明T7EⅠ-SAD具备与HJ结构特异结合的能力.为具有细胞毒性蛋白的表达提供...     

拟南芥Antiquitin基因的原核表达和生物信息学分析

将拟南芥Antiquitin基因重组到原核表达载体pMAL-c4x和pET41中,在T7 Express菌株中诱导表达,经Amylose和Ni-NTA亲和层析柱纯化获得重组蛋白.SDS-PAGE结果表明:MBP和His-tag融合的拟南芥Antiquitin主要以可溶性形式存在,表达量分别占细胞总蛋白的25.1%和39.4%.以乙醛和NAD~+为底物测定融合蛋白活性,结果显示:His-tag融合的Antiquitin具有醛脱氢酶活性,比活力为8.98 U/mg,乙醛的表观K_m和V_(max)值分别为0.98 mmol/L和12.75 U/mg.序列比对和结构预测结果显示:拟南芥Antiquitin包含该家族蛋白典型的催化结构域、NADH结合结构域和寡聚化结构域,活性中心残基为Gly238、Gly291、Glu391、Phe393.     

核酸酶P1的原核表达、纯化及酶学特性分析

为了建立一种核酸酶P1(Nuclease P1,NP1)的原核表达纯化系统,首先采用重叠延伸PCR将22段寡核苷酸拼接,获得人工合成的NP1基因。将其克隆至分泌型表达载体pMAL-p4X获得重组质粒pMAL-p4X-NP1,然后将重组载体转化T7 Express和Origami B(DE3)菌株诱导表达,利用Amylose亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并对其活性、热稳定性和金属离子依赖性进行系统分析。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白MBP-NP1(Maltose binding protein-NP1)在T7 Express和Origami B(DE3)菌株中均可表达,且以可溶性形式存在。活性检测表明Origami B(DE3)菌株中获得的重组蛋白活性高于T7 Express菌株(75.48 U/mg:51.50 U/mg);利用蛋白酶Factor Xa切除MBP标签后,两种重组蛋白的比活力均有提高,分别为258.13 U/mg和139.20 U/mg。重组NP1表现出良好的热稳定性,80℃温浴30 min后重组酶仍具有90%以上的活力。2.0 mmol/L Zn2+对NP1有比较明显的激活作用,相同浓度的Cu2+则对该酶有强烈的抑制作用。该研究实现了NP1在大肠杆菌系统中的功能性表达,为NP1纯酶的制备提供一个替代途径。     

小麦β-胡萝卜素异构酶基因定位克隆及表达分析

β-胡萝卜素异构酶(D27)是独脚金内酯(SLs)合成通路的第一个酶。该研究以普通小麦‘中国春’为材料,通过RT-PCR克隆了小麦β-胡萝卜素异构酶对应cDNA(TaD27),并对其在不同组织和低磷胁迫下的表达进行分析。结果显示:(1)克隆获得2个高度同源cDNA片段,分别定位于7A、7D染色体的长臂,命名为TaD27-7AL和TaD27-7 DL;序列分析发现,7B染色体长臂上还存在另一个同源基因TaD27-7BL。(2)3个TaD27基因均包含7个外显子,编码区长度分别为828bp(7AL)、840bp(7BL)和843bp(7DL),编码蛋白的N-端均含有叶绿体转运肽;进化分析表明,植物D27蛋白主要聚集在3个进化枝中,小麦、水稻和玉米等单子叶植物的D27高度同源,聚集在同一进化分枝。(3)组织表达分析表明,TaD27基因在叶、叶鞘和茎中的表达量较高,在幼穗中的表达量相对较低,在根中的表达量最低;低磷胁迫下,TaD27在根中的表达量先下降后升高,胁迫至6~12h时,表达量达到最低,96h时基本恢复至初始状态,而在叶中表达量则是先升高后下降,6h达到峰值,12h基本恢复到初始水平,随后表达量继续下降。     

拟南芥基因密码子偏爱性分析

密码子偏爱性对外源基因的表达强度有一定影响,特别是编码蛋白质N端7～8个氨基酸残基的密码子.通过对拟南芥染色体中26 827个蛋白质对应的基因密码子进行分析,得到了编码氨基酸的61种密码子在拟南芥中的使用频率,并与大肠杆菌和哺乳动物进行了比较,结果表明三者间的密码子偏爱性有较大差异.这一分析结果对于动物基因在植物中的表达,及植物基因在微生物中的表达具有一定指导意义.同时提供了一种直接以XML文档为数据源解析巨型XML格式染色体数据的方法.     

共转化大肠杆菌hemA和hemL基因增强小麦过氧化物酶WP1在原核系统中的功能性表达

小麦种子过氧化物酶WP1属于含血红素的植物Ⅲ型过氧化物酶,该酶不仅具有抗真菌活性,而且影响面粉加工品质。为提高WP1在大肠杆菌中的功能性表达,构建了用于提高大肠杆菌内源血红素合成,包含hemA和hemL基因的重组质粒pACYC-A-L,将其分别与包含WP1基因的分泌型和非分泌型表达载体pMAL-p4x-WP1与pET21a-MBP-WP1共同转化大肠杆菌T7 Express菌株;利用直链淀粉(Amylose)亲和层析柱纯化获得MBP-WP1融合蛋白,并以2,2’-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物检测重组WP1的催化能力。结果表明,含pACYC-A-L的宿主菌28℃诱导12 h后,培养液中5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)含量可达146.73 mg/L,卟啉类物质含量也显著上升。共转化pACYC-A-L和pMAL-p4x-WP1比单独转化pET21a-MBP-WP1获得的重组WP1的比活力提高14.6倍。该研究不仅成功地增强了小麦WP1在大肠杆菌中的功能性表达,同时为其他具有重要生物学功能并含血红素辅基蛋白的功能性表达提供了有益参考。