大肠杆菌甘露糖异构酶(MI)基因克隆及功能研究

甘露糖异构酶(EC 5.3.1.7,Mannose isomerase,简称MI)能够催化果糖和甘露糖之间的异构转化.甘露糖加氢催化形成甘露醇,因此甘露糖异构酶的研究为工业生产甘露糖和甘露醇提供了新的可能途径.本研究以Escherichia coli JM109基因组DNA为模板,PCR扩增mi基因.结果表明,所克隆的mi基因与E.coli str.K-12 substr.MG1655的MI基因序列一致性为99.9%,氨基酸序列一致性为99%.该基因能够在E.coli BL21(DE3)中进行高效诱导表达,诱导出51.4 kD的特异性融合蛋白.酶学研究表明,该酶最适反应温度为37℃,最适pH为7.5,甘露糖为最佳反应底物,反应平衡时果糖与甘露糖的比值约为2.7.     

重组嗜热栖热菌海藻糖合酶制备海藻糖的工艺条件优化

海藻糖具有独特的生物活性,在多种行业应用广泛。海藻糖合酶能够专一性催化麦芽糖一步生成海藻糖。本文通过PCR扩增获得了来源于Thermus thermophilus ATCC33923的海藻糖合酶基因Tre S,构建了基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-24a(+)-Tre S。工程菌在摇瓶中发酵28 h时,胞内海藻糖合酶酶活达到最高值为6.4 U/m L。进一步研究了该重组酶制备海藻糖的影响因素,发现当以10%麦芽糖为底物,初始反应p H 7.5,加酶量为15 U/g麦芽糖,40℃,150 r/min反应24 h,转化率达到最高值,为49.0%。当底物浓度提高至20%~40%时,转化率为45.4%~46.2%。     

基于大肠杆菌K-12MG1655的narG基因缺失荧光工程菌的构建

本研究应用PCR扩增两翼与靶基因上下游同源含有Cmr(氯霉素抗性基因)的片段,经电击转化至E.coli K-12 MG1655中。在λRed重组系统的帮助下,通过氯霉素抗性基因两侧的同源序列在体内与narG基因发生同源重组,随后利用Cmr两端的FTP位点,通过FLP酶专一性重组将Cmr删除,获得narG基因精确敲出且不带Cmr的E.coli K-12 MG1655(ΔnarG)突变株。最后转化NO诱导的GFP(绿色荧光蛋白基因)报告基因质粒p SB1C3_BBa_K 381001,获得具有对(亚)硝酸盐荧光应答的重组发光工程菌株K-12 MG1655(ΔnarG)::GFP。生长曲线测定结果表明,narG基因的敲出对大肠杆菌正常生长无显著影响(p0.05)。荧光工程菌对(亚)硝酸盐的应答结果表明,E.coli K-12 MG1655(ΔnarG)::GFP对(亚)硝酸盐的敏感性相对于E.coli K-12 MG1655::GFP提高了2.5倍左右。且在0~8μmol/L的硝酸盐浓度下符合线性关系:(R2=0.968 3);在0~4μmol/L的亚硝酸盐浓度下符合线性关系:(R2=0.997 5)。本研究所构建的E.coli K-12 MG1655(ΔnarG)::GFP能够有效检测痕量(亚)硝酸盐,可为检测食品和水质中(亚)硝酸盐提供新的方法选择。     

拟南芥海藻糖酶基因克隆及其在大肠杆菌中高效表达与功能研究

从拟南芥幼苗中提取RNA,通过RT-PCR克隆得到海藻糖酶基因后,将其构建到原核高效表达载体pET30a( )上并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,继而对纯化得到的海藻糖酶蛋白进行活性检测和酶学特性研究.实验结果表明,植物源的海藻糖酶基因在异体大肠杆菌中能够高效表达,纯化获得的海藻糖酶蛋白在试管条件下具有较高的海藻糖水解活性,其活性最适温度为45℃.通过GC-MS分离检测,可以明显地看到酶反应过程中底物海藻糖和产物葡萄糖的含量随反应时间变化的消长关系,这充分证明克隆基因在大肠杆菌中的表达产物具有海藻糖酶的功能.     

产普鲁兰酶重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

通过对产普鲁兰酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-s-pul菌株在发酵过程中质粒稳定性和普鲁兰酶生成量的考察,发现不同宿主对质粒稳定性及酶活性有重要影响。本文利用E.coli BL21(DE3)p Lys S菌株为宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)p Lys S/p ET28a-s-pul,通过控制外源蛋白的本底表达,提高了重组菌株的质粒稳定性。优化发酵培养基和发酵条件以后,重组菌产普鲁兰酶能力由480 U/m L提高至627 U/m L,增幅为30.6%。研究结果认为,严格控制外源蛋白的本底表达,是改善重组菌稳定性的重要方法之一。     

大肠杆菌BL21(DE3)膜组分相关基因的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响

摘要:【目的】探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waaF或msbB的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】运用Red重组技术将E.coli BL21 (DE3)染色体上的基因waaF或msbB敲除,构建敲除菌株E.coli BL21(ΔwaaF)、E.coli BL21(ΔmsbB)。将本实验室保存的带有β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)、青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase,PGA)基因的重组质粒pET-ffase、pET-pga分别转入敲除菌株及出发菌株中,构建工程菌株E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase、E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-ffase、E.coli BL21(DE3)/pET-ffase、E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-pga、E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-pga、E.coli BL21(DE3)/pET-pga。最后通过摇瓶发酵研究敲除菌株对β-FFase、PGA胞外分泌的影响。【结果】当诱导表达4 h,以出发菌株E.coli BL21(DE3)为宿主时,β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌量占总表达量的2.6%,以敲除菌株ΔmsbB为宿主时,胞外分泌量达到19.7%,而以敲除菌株ΔwaaF为宿主时,胞外分泌量达到50.9%。另外,当诱导表达24 h,以敲除菌株ΔwaaF为宿主时,青霉素G酰化酶PGA的胞外酶活是出发菌株中的4.1倍,达到1708 U/L。【结论】本研究成功构建了敲除菌株ΔmsbB和ΔwaaF,ΔmsbB能明显增强β-FFase的胞外分泌,而ΔwaaF对β-FFase和PGA的胞外分泌均有显著的强化作用。     

拟南芥海藻糖酶基因克隆及其在大肠杆菌中高效表达与功能研究

从拟南芥幼苗中提取RNA, 通过RT-PCR克隆得到海藻糖酶基因后, 将其构建到原核高效表达载体pET30a(+)上并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达, 继而对纯化得到的海藻糖酶蛋白进行活性检测和酶学特性研究。实验结果表明, 植物源的海藻糖酶基因在异体大肠杆菌中能够高效表达, 纯化获得的海藻糖酶蛋白在试管条件下具有较高的海藻糖水解活性, 其活性最适温度为45℃。通过GC-MS分离检测, 可以明显地看到酶反应过程中底物海藻糖和产物葡萄糖的含量随反应时间变化的消长关系, 这充分证明克隆基因在大肠杆菌中的表达产物具有海藻糖酶的功能。     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.     

嗜热古菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的序列分析、基因克隆与异源表达

将Methanopyrus sp.SNP6进行功能基因组测序,获得S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam)序列,并进行序列分析。将sam基因扩增后连接至表达质粒p ET-28b(+),转化E.coli BL21(DE3),获得重组菌后进行诱导表达。生物信息学分析表明,sam基因编码蛋白的理论分子量为44 086.4Da,三级结构为同源四聚体,与其他相关古菌来源的S-腺苷甲硫氨酸合成酶的蛋白序列较保守。实验结果显示,构建的重组表达质粒p ET28b(+)-sam可在E.coli BL21(DE3)宿主菌中高水平表达。重组蛋白的分子量与预期值基本一致,部分为胞内可溶性表达,另一部分以包涵体形式存在。本研究首次实现了Methanopyrus sp.SNP6菌株S-腺苷甲硫氨酸合成酶的异源表达,为后期的蛋白纯化、酶学性质研究和酶促转化法生产S-腺苷甲硫氨酸奠定了理论基础。     

重组大肠杆菌多基因串联表达合成反式-4-羟基-L-脯氨酸

[目的]得到表达多个基因的重组大肠杆菌,以期实现葡萄糖为碳源生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。[方法]以菌液为模板,PCR得到不同来源的proB、proA、proC、p4h基因,重叠PCR串联相邻基因,所得片段通过无缝组装与p ET-28a载体连接,并在大肠杆菌BL21中表达,筛选阳性表达菌株,电泳及测序验证,重组菌在30 ml MCG培养基摇瓶中发酵,分光光度法和HPLC检测产量。[结果]0.5 mmol/L IPTG诱导24 h,5组串联基因成功在大肠杆菌中表达,并以葡萄糖为碳源,获得产物反式-4-羟基-L-脯氨酸,培养基不添加L-脯氨酸时E.coli BL21/p ET-28a-BAHHbs、E.coli BL21/p ET-28a-HBACkp和E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg产量达到0.28 g/L、0.16 g/L和0.29 g/L,添加4 mmol/L的L-脯氨酸时,分别为0.64 g/L、0.55 g/L和0.74 g/L。[结论]proB、proA、proC及p4h基因成功在大肠杆菌中表达,5株重组菌在30℃摇瓶中诱导表达24 h得到产物反式-4-羟基-L-脯氨酸,其中E.coli BL21/p ET-28a-HBAmg产量达到0.74 g/L,为今后在发酵罐中生产奠定基础。     

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20（b）中构建成质粒pET—amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20（b）中构建成质粒pET—amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET—amyAⅠ中构建成质粒pET—amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E．coli JM109（DE3）,并将重组质粒pET—amyAⅠ转化E．coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIL。通过IPTG诱导测酶活性：在E．coli JM109（DE3）中表达的重组酶（pET—amyA）、（pET—amyAⅠ）、（pET—amyAⅡ）的酶活分别是1658．0U／mL、6721．7U／mL、8904．5U／mL,在E．coil BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中表达的重组酶（pET—amyAⅠ）的酶活是13867．7U／mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。     

稻纵卷叶螟海藻糖酶基因的克隆、分子特性和表达分析

【目的】海藻糖酶(trehalase,Tre)是昆虫体内海藻糖代谢的一个关键酶,包括可溶型(Tre1)和膜结合型(Tre2)两种类型,在昆虫发育和能量调节中具有重要作用。本研究旨在克隆稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis海藻糖酶基因(Cm Tre),解析其在稻纵卷叶螟不同发育阶段和不同组织中的表达模式,分析该基因及酶蛋白的分子特征。【方法】通过稻纵卷叶螟转录组数据结合RACE技术,克隆稻纵卷叶螟Cm Tre的全长c DNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)解析Cm Tre在稻纵卷叶螟不同发育阶段及成虫不同组织部位的m RNA表达模式。【结果】获得两种类型的稻纵卷叶螟Cm Tre基因,即可溶型海藻糖酶基因Cm Tre1和膜结合型海藻糖酶基因Cm Tre2。Cm Tre1的全长c DNA长度为2 364 bp,开放阅读框长1 704 bp,编码567个氨基酸;Cm Tre2的全长c DNA长度为2 079 bp,开放阅读框长1 923 bp,编码640个氨基酸。生物信息学分析表明,Cm Tre前端有一个信号肽,Cm Tre1无跨膜结构,Cm Tre2有一个跨膜结构。同源性和聚类分析表明,Cm Tre1和Cm Tre2的氨基酸序列与竹蠹螟Omphisa fuscidentalis海藻糖酶Tre1和Tre2氨基酸序列的一致性最高,分别为74%和79%。同源建模预测结果显示,Cm Tre1的三维分子结构包含19个α螺旋和2个β折叠片;Cm Tre2的三维分子结构含有23个α螺旋,没有β折叠片。RT-q PCR结果显示,Cm Tre在稻纵卷叶螟整个发育历期都有表达,在成虫期表达水平最高,在整个幼虫期都有相对稳定的表达;Cm Tre1在蛹期表达水平最低,Cm Tre2在5龄幼虫时期表达水平最低。Cm Tre在所检测的成虫组织(中肠、体壁、马氏管、头、卵巢、脂肪体、肌肉和精巢)中均有表达;Cm Tre1在中肠和体壁中的表达水平较高,Cm Tre2在肌肉和中肠中的表达水平较高。【结论】本研究克隆了稻纵卷叶螟两种类型的海藻糖酶基因,分析了其基因特征和表达模式。研究结果为阐明海藻糖酶基因的功能进而以海藻糖酶基因为靶标防治害虫奠定了基础。     

玉米芯-海藻酸钠共固定化重组大肠杆菌生产NAD

对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)p ET30α(+)-Nmnat共固定化生产NAD的固定化条件进行研究。比较不同载体和不同固定化方法,确定玉米芯—海藻酸钠共固定化为最佳方法。优化共固定化条件,得到的最适条件为:固定化过程中吸附和混合时间分别为0.5 h、1 h,海藻酸钠质量分数为3%,玉米芯-全细胞质量比为5∶4,CaCl_2质量分数为2%,转速为140 r/min。与游离细胞相比,共固定化细胞具有更高的产率和更好的操作稳定性。玉米芯-海藻酸钠共固定化适宜用于重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)p ET30α(+)-Nmnat生产NAD。     

应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR;通过Hi Trap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E. coli BL21(DE3)-DAR和E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2. 59mmol/L、1. 64μmol/(L·min·mg)、12. 3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95. 86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E. coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51. 26g/L,转化率为81. 37%,生产速率为5. 13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。     

杓兰果胶杆菌海藻糖酶的克隆表达及应用

海藻糖酶在工业发酵和食品医药等领域应用广泛,我国缺乏性能优良工业品种的海藻糖酶,同时在应用研究领域还不够深入。本研究从自然界筛选获得一株产酸性海藻糖酶的杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii),克隆获得其海藻糖酶基因PCTre,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)体系中实现了重组表达,在5L发酵罐上28h产酶达到4130U/mL。酶学性质研究显示,PCTre能特异性水解海藻糖,最适反应温度和pH分别是35℃和5.5,在pH4.0、4.5、5.0处理8h后残余酶活仍超过80%,表现出良好的耐酸性。同时该酶还显示出优良的有机溶剂耐受性,在20%(V/V)乙醇溶液中处理24h仍能保留60%的酶活。进一步在含有20%(V/V)乙醇和7.5%海藻糖的模拟发酵体系中,当添加500U/L PCTre,可在16h内完全水解海藻糖,具有良好的应用于工业乙醇发酵的潜力。     

胰高血糖素样肽-1融合蛋白在原核系统中的表达

[目的]构建点突变的GLP-1Gly8,并与人血清白蛋白(HSA)结构域Ⅰ融合,延长GLP-1的半衰期。[方法]采用常规PCR扩增白蛋白结构域Ⅰ片段,利用SOE-PCR扩GLP-1Gly8基因并将两个基因拼接,得到的HSA-GLP-1Gly8融合基因经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到p ET30a表达载体,重组质粒p ET30a-HSA-GLP-1Gly8转入E.coli BL21(DE3)宿主菌中进行IPTG诱导表达。[结果]PCR扩增分别获得140 bp的GLP-1Gly8基因499 bp的HSA的片段及经融合后的HSA-GLP-1Gly8基因。表达载体p ET30a-HSA-GLP-1Gly8在E.coli BL21(DE3)宿主菌中经IPTG诱导,过表达了分子量约为22 k Da的融合蛋白。[结论]成功构建了p ET30a-HSA-GLP-1Gly8原核表达载体,融合蛋白在BL21(DE3)菌中以包涵体的形式过表达。     

天蓝色链霉菌海藻糖合酶的异源表达、活性分析及重组菌全细胞转化合成海藻糖的条件优化

从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因 (ScTreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行了异源表达,通过 Ni-NTA 亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经 SDS-PAGE 测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性质发现该酶最适温度35 ℃;最适pH 7.0,对酸性条件比较敏感。通过同源建模和序列比对分析,对该基因进行定点突变。突变酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍,突变酶A165T相对提高了1.39倍,海藻糖转化率分别提高了14%和10%。利用突变体重组菌K246A进行全细胞转化优化海藻糖的合成条件并放大进行5 L罐发酵,结果表明：在麦芽糖浓度300 g/L、初始反应温度和pH分别为35 ℃和7.0的条件下,转化率最高达到71.3%,产量为213.93 g/L;当底物浓度增加到700 g/L时,海藻糖产量仍可达到465.98 g/L。     

重组人载脂蛋白ApoA-I表达条件的优化

对大肠杆菌DH5α发酵培养表达人载脂蛋白ApoA-Ⅰ的发酵条件进行了优化研究.结果表明将重组质粒pBV220-ApoA-Ⅰ转化不同的大肠杆菌宿主菌,筛选得高表达水平的E.coli DH5α/pBV220-ApoA-Ⅰ表达系统,摇瓶发酵表达率为22.2%,BL21(DE3)的表达水平与其相当,而TG1的表达率只有11%.在FMG-5L发酵罐进行发酵条件优化,认为细胞生长培养的最适pH为7.0,重组ApoA-Ⅰ表达时的最适pH为7.4.分批发酵的初始糖浓度为3.0 g·L-1,且碳氮源的最佳比例为21,使重组ApoA-Ⅰ表达率达总蛋白的40%,浓度达2.86g·L-1.     

来源于Laceyella sp.的α-淀粉酶基因克隆、重组表达及酶学性质研究

从土壤中筛选产淀粉酶菌株,对其淀粉酶基因进行克隆及异源表达,分析其酶学性质。采用固体淀粉筛选培养基,从安阳面粉厂附近土壤里分离得到一株产淀粉酶的菌株Laceyella sp.,编号为MF-8-1。然后利用同源克隆的方法得到淀粉酶编码基因AmyL。将AmyL与表达载体pET-22b(+)连接构建pET-22b-AmyL重组质粒,并转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达。最后对重组酶进行分离纯化以及酶学性质测定。AmyL在E.coli中成功表达,重组酶AmyL分子量为55 kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为6.0。在温度低于60℃时,有较好的温度稳定性;在pH 6.0-10.0内较稳定。酶的动力学研究表明,该酶的比活、Km和Vmax分别为185.39 U/mg、0.95 mg/mL、343.12μmol/(min·mg)。结果表明,AmyL在中温碱性条件下具有高活性且保持稳定,在洗涤剂、纺织、造纸等行业具有潜在的应用价值。     

哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达

经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶(GR)基因,并构建其原核表达载体,以获得相应的表达蛋白。将GR和p ET-32a(+)通过Bam H I和Xho I双酶切后,体外用T4连接酶连接,构建重组质粒p ET-GR;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,应用SDS-PAGE分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE电泳获得分子量约为68.9 k D融合蛋白条带。在E.coli BL21(DE3)中重组质粒p ET-GR的表达条件为28℃,0.7 mmol/L的IPTG浓度诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。