α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。     

葡萄酒酵母不对称还原苯甲酰甲酸合成（R）-扁桃酸

研究了葡萄酒酵母不对称还原制备（R）-扁桃酸的转化,并将其放大至反应罐进行小试研究。通过转化条件的优化,在密闭条件下,当底物质量浓度为10g/L时,苯甲酰甲酸的产率达到72％,扁桃酸的对应过量值（e.e）值达到99％以上。实验发现,该微生物具有很好的催化稳定性,全细胞经过10批次反应,产率无明显降低,产物对映体过量值均高于98％。转化反应放大至7L反应罐体系后,S.ellipsoideus,仍然具有良好的催化性能,产率提高到81％,e.e值保持在99％。     

酶促生物转化丙酮酸生产的研究

建立了一种利用琥珀酰亚胺代谢从延胡索酸生产丙酮酸的新工艺。经诱变得到恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida 15160)的缬氨酸或(与)亮氨酸营养缺陷型变异株M29,该菌株在最优条件下作用72h将1mol／L延胡索酸转化成为821mmol／L丙酮酸。     

大肠杆菌NAD+合成关键酶的克隆表达及发酵优化

【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞生命周期中具有重要的作用,其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略,获得高产NAD~+菌株,对于NAD~+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。【方法】首先通过内源性调节,对代谢途径中的关键酶基因进行强化,过量表达和共表达NAD~+合成途径中的关键酶基因pncB、nadD和nadE;其次,通过外源调节增加NAD~+前体物,优化诱导条件提高发酵过程中关键酶的表达量,增加NAD~+的合成量;最后在单因素优化试验的基础上,以NAD~+含量为响应值,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究3个显著性影响因素相互作用对NAD~+积累量的影响,确定最佳的优化条件。【结果】根据关键酶基因强化策略,构建了7株重组菌,其中重组菌E.coli BL21/p ET-21a-nad E-pncB胞内NAD~+含量相比初始菌株E.coli BL21/pET-21a提高了405.2%。通过对该菌株诱导条件和NAD~+合成前体的优化,使用Design Expert 8.0分析实验数据,得出该重组菌株的最佳发酵条件为:诱导温度控制在15–20 oC,OD_(600)为0.6–0.8时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、诱导时长控制在24 h。NAD~+含量在最优条件下实验验证值可达43.16μmol/g DCW,与优化前相比提高了123.6%,与初始菌株相比提高了1029.8%。【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB和nadE,胞内NAD~+合成量明显增加,前体物以及诱导条件的外源调节使NAD~+积累量达到最佳优化值。实现了提高NAD~+含量的目标,胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。     

亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶高效共表达制备L-叔亮氨酸北大核心CSCD

【目的】通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究,获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂,实现L-叔亮氨酸"一锅法"高效不对称合成。【方法】以来自于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亮氨酸脱氢酶(LDH)和来自芽孢菌属(Bacillus sp.)的葡萄糖脱氢酶(GDH)为模板,考察单质粒共表达,双质粒共表达和融合表达等3种共表达策略对重组细胞中亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活的影响,比较不同酶活比例和不同催化剂形式对三甲基丙酮酸不对称还原制备L-叔亮氨酸效率的影响。【结果】研究发现不同共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的影响存在明显差异。亮氨酸脱氢酶在不同策略下均能够正常表达,而葡萄糖脱氢酶在融合表达时没有活力,当C端含有组氨酸标签时,表达蛋白活性低。通过表达优化,获得3株亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶高效表达且具有不同酶活比例的重组菌。比较粗酶液和全细胞形式下的催化效率,发现酶活比例及催化剂形式对不对称还原反应效率具有重要影响。确定单质粒串联表达C端不含His标签重组菌E.coli BL21/p ET28a-L-SD-AS-G为最佳催化剂,以粗酶液进行转化时,完全转化0.5 mol/L底物所需菌体量为15 g/L,辅酶量为0.1 mmol/L。【结论】采用单质粒共表达策略,成功构建出1株具有较高亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活性的重组菌,实现高效催化TMP合成L-Tle。     

关键酶基因转录水平对重组大肠杆菌合成NAD+的影响

[目的] 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide）是生物体内一种重要的辅因子,其细胞内含量对于NAD⁺依赖型氧化还原反应和有关生化合成代谢具有重要意义。为强化辅因子合成,本文通过不同诱导条件下关键酶基因转录水平与产物合成水平的相关性分析,利用增加正向关键酶基因拷贝数策略提高胞内氧化型辅酶NAD⁺的浓度。[方法] 以实验室前期构建的大肠杆菌NA016为出发菌株,分别从诱导温度、诱导剂浓度、诱导时机三个方面进行了诱导条件的优化,并利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术对代谢改造中的有关过表达基因进行了转录水平分析,确定了NAD⁺含量与这些过表达基因转录水平之间的相关性,增加对NAD⁺合成代谢具有正向作用的基因拷贝数以进一步提高胞内NAD⁺水平。[结果] 通过诱导条件优化实验确定菌株NA016的最适诱导温度,在诱导时机为OD₆₀₀达到0.6时加入0.8 mmol/L的IPTG可使胞内NAD⁺含量提高35.37%;转录水平方面分析发现基因nadE和pncB的表达对NAD⁺的合成具有正向调节作用。进一步增加菌株NA016中关键酶基因nadE和pncB的拷贝数可使辅酶含量再次提高22.46%,最高可达41.66μmol/g DCW。[结论] 优化诱导条件和增加关键酶基因拷贝数可以提高氧化型辅酶NAD⁺的含量,这为促进大肠杆菌胞内NAD⁺合成的研究提供借鉴意义。     

产普鲁兰酶重组大肠杆菌质粒稳定性的研究

通过对产普鲁兰酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-s-pul菌株在发酵过程中质粒稳定性和普鲁兰酶生成量的考察,发现不同宿主对质粒稳定性及酶活性有重要影响。本文利用E.coli BL21(DE3)p Lys S菌株为宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)p Lys S/p ET28a-s-pul,通过控制外源蛋白的本底表达,提高了重组菌株的质粒稳定性。优化发酵培养基和发酵条件以后,重组菌产普鲁兰酶能力由480 U/m L提高至627 U/m L,增幅为30.6%。研究结果认为,严格控制外源蛋白的本底表达,是改善重组菌稳定性的重要方法之一。     

NAD(P)依赖型氧化还原酶分离纯化技术进展

NAD(P)依赖型的氧化还原酶是一类重要的生物催化剂,在生物合成中被广泛应用。以亲和技术为基础的分离纯化方法与其它分离制备方法相比具有高选择性、高活力回收等优点。本文着重讨论亲和色谱技术在NAD(P)依赖型的氧化还原酶的分离纯化及制备中的研究进展。     

固定化细胞生物催化制备(S)-苯基乙二醇的研究

采用海藻酸钙固定化细胞方法能有效提高近平滑假丝酵母催化(RS)-苯基乙二醇(S-PED)去消旋化反应的稳定性,在优化反应条件下,固定化细胞催化批次由游离细胞的2次提高至6次,产物可保持高光学纯度(>95%)、高产率(>85%)。与化学合成液晶掺杂剂S-1011的理化特性对比结果表明,生物催化法制备获得的(S)-PED能够替代化学法制备的相同产品。