显示环氧树脂厚切片中多糖,蛋白质和脂类的细胞化学方法

用花生(Arachis hypogaea L.)种子的子叶组织作为模式材料,Epon 812包埋的组织进行厚切片后,按下列三步染色。第一步,PAS 反应:(1)在0.5%高碘酸(0.3%硝酸配制)中10分钟;(2)自来水洗1—2分钟,蒸馏水经过;(3)锡夫试剂中30分钟;(4)偏亚硫酸氢钠溶液三次洗涤,每次2分钟;(5)自来水洗5分钟,蒸馏水经过。第二步,苏丹黑 B 液染色:(1)70%酒精中1—2分钟;(2)新鲜配制的0.3%苏丹黑 B 液(70%酒精配制)中染色,40—60℃,30分钟至1小时;(3)70%酒精中分色1分钟;(4)自来水冼,蒸馏水经过。第三步,考马斯蓝染色:(1)7%醋酸中1—2分钟;(2)1%考马斯蓝(7%醋酸配制)中染色,60℃,20分钟;(3)0.1%醋酸液中分色1分钟;(4)自来水冼5分钟,蒸馏水经过;(5)自然干燥或在40℃电热温箱中烘干。干燥后的切片用甘油胶封固。经这三步染色的切片,细胞内的多糖、脂类和蛋白体同时被显示:淀粉粒及纤维素的细胞壁为樱红色,油滴为黑色,蛋白体为蓝色。制片能长期保存。     

多聚甲醛固定对流式细胞术检测HepG2细胞整合素αVβ3的影响

目的:检测HepG2细胞表面整合素αVβ3的表达情况,同时探讨多聚甲醛的固定处理对HepG2细胞表面αVβ3检测的影响。方法:分别用0.25%的胰蛋白酶和1%的EDTA消化收集HepG2细胞,以FITC标记的抗αVβ3单抗检测细胞表面αVβ3的表达情况;在检测中,用2%浓度的多聚甲醛固定细胞后,采用流式细胞仪测定多聚甲醛固定组和未固定组HepG2细胞的平均荧光强度和阳性细胞率,对结果进行统计学分析。结果:以胰蛋白酶消化HepG2细胞后,抗αVβ3单抗标记的阳性细胞率为3.6%,远低于EDTA消化组的阳性细胞率(47%)。多聚甲醛固定组的平均荧光强度为2.23,阳性细胞率为4.6%;而未固定组的平均荧光强度为6.97,阳性细胞率为30.1%。以上结果经统计学分析,均具有显著性差异(P<0.05)。结论:HepG2细胞表达整合素αVβ3,多聚甲醛固定处理可干扰对HepG2细胞αVβ3的检测。     

内耳整块染色石蜡包埋制片法

内耳制片常用的是火棉胶——石蜡双重包埋H-E片染法。此法制片步骤较多,不易掌握。我采用Bouin氏固定液固定,H-E整块染色、石蜡包埋法制片,操作简便,易于成功,内耳的基本结构(前庭膜、盖膜、毛细胞都完好无损,如取材适当,可在同一切片同时显示壶腹嵴。染色液的配制: 1.苏木精染液的配制: 苏木精 25毫克硫酸铝钾 1.25克碘酸钠5毫克蒸馏水 75毫升由于以上药品称量很小,故需称的较准确。配出来的液体若呈现混浊,则是因为以上药品(主要是碘酸钠)称得不准造成的,这种混浊染色液不能用。 2.复制伊红染色液的配制: 将伊红(Y或B均可)0.5克溶于3毫升蒸馏水中,溶解后将冰醋酸—滴—滴加于其中,边滴边搅动,     

九月份生物各学科实验准备

植物学(实验一和实验二) 材料用具:显微镜(低倍镜)、小块紫色洋葱鳞茎(若无紫色洋葱时,还需准备碘液染色)、内盛清水的小烧杯、吸管、镊子、刀片、牙签(代替解剖针)、载玻片、盖玻片、小片吸水纸、绘图纸,番茄、红色柿子椒各一个(演示用)。示范镜的准备:1.示成熟的番茄果肉细胞:用牙签挑取果肉细胞制成装片观察。2.示辣椒表皮细胞:将柿子椒用小刀切成小块,清除掉果肉制成无色表皮细胞,观察胞间连丝,如用卡宝染液(改良苯酚品红染色液)染色效果更好。卡宝染色液配制方法如下: ①取3克碱性品红,溶于100m170％酒精中,配成母液     

龙胆紫希夫氏液显示DNA染色新方法

应用龙胆紫配制成Schiff(希夫氏)试剂,在微波辐射下进行Feulgen染色,结果使正常及良、恶性肿瘤组织细胞核内DNA着紫红色,并能应用真彩色图像仪进行DNA的定量分析.其方法操作简便,便于临床病理诊断应用.现介绍如下.标本的采集:活检手术切取的肿瘤组织100余例,经甲醛固定,石蜡包埋.切片,厚5μm.染液的配制:①8.3%盐酸水溶液(HCl8.3ml、蒸馏水 91.7ml);②龙胆紫(上海试剂站)希夫氏试剂的配制同PAS方法,以龙胆紫代替碱性品红;③亚硫酸氢盐溶液(10%偏重亚硫酸钠溶液5ml、1mol/L-HCl5ml、蒸馏水90ml).染色步骤;①切片脱蜡至水—蒸馏水;②8.3%盐酸水溶液水解切片1min(微波仪5档),蒸馏水洗;③     

变色素2R水溶液显示神经髓鞘的新方法

本文应用变色素 2R(Chromotrope 2R)显示神经髓鞘的新方法,将神经髓鞘染成红色,形态清晰,颜色鲜艳,操作简便,易于掌握,是显示神经髓鞘较为优良的方法,为神经组织的病理诊断和研究提供了新的技术方法.标本来源:尸检脑组织、脊髓和周围神经组织,经10%甲醛固定,石蜡包埋,切片5μm.试剂的配制:①变色素2R染液:变色素2R(北京化工厂)0.5g,磷钨酸0.6g,冰醋酸1.0g,蒸馏水加至100ml.放置4℃冰箱长期保存,用前回温.②0.2%冰醋酸水溶液:冰醋酸0.2ml,蒸馏水加到100ml.染色步骤:     

三种固定液对两种氧化应激细胞模型Bclin1和LC3蛋白免疫荧光染色的影响

摘要 目的：比较采用三种不同的固定液对两种氧化应激细胞模型Beclin1和LC3蛋白免疫荧光染色的影响。方法：本研究使用丙酮/甲醇（1:1）固定液、甲醇固定液和4%多聚甲醛三种固定液分别对氧化应激细胞模型大鼠原代心肌成纤维细胞和MCF-7乳腺癌细胞株进行固定,然后再分别进行免疫荧光双染实验,对比三种固定液固定后对自噬关键调控蛋白Beclin1和LC3染色效果。结果：三种固定液对氧化应激细胞模型Beclin1和LC3蛋白免疫荧光染色结果存在较大差异。丙酮/甲醇（1:1）固定液固定后免疫荧光染色效果最佳,细胞结构清晰可见,两种蛋白定位表达清晰,甲醇固定液次之,4%多聚甲醛固定液效果欠佳。结论：在对大鼠原代心肌成纤维细胞和MCF-7乳腺癌细胞进行自噬相关蛋白免疫荧光双染色实验中,在使用其它固定液染色效果不佳的情况下,可以选择应用丙酮/甲醇（1:1）固定液固定,再进行免疫荧光染色;根据不同实验需求相应选择更适宜的固定液,以达到最佳的荧光染色结果。     

一种简易植物细胞无丝分裂的观察实验

大蒜用水培法长出幼苗。取幼苗叶鞘内表皮,放入酸酒精中固定0.5—1分钟,用镊子夹至载玻片上摊开,再用0.25％龙胆紫染色2分钟,盖上盖玻片即可镜检。细胞质呈浅蓝色,细胞核为紫蓝色,核仁折光性强。可清晰看到细胞无丝分裂的几种形态:①     

PEG诱导人类细胞和元麦原生质体融合初步尝试

本实验尝试以PEG诱导Hela细胞与元麦原生质体融合进行了初步观察。 实验方法是将Hela细胞悬液250万/0.25 ml和元麦原生质体悬浮液500万/0.25 ml混合,然后加入0.125 ml PEG溶液(PEG 6,000分子量0.09M,CaCl_2·2 H_2O 10.5 mM,葡萄糖0.25 M,KH_2PO_4·7H_2O 0.7mM,pH 5.5)于37℃孵育30分钟,接着以RPMI-1640培养液洗掉PEG,离心收集细胞培养于小玻瓶中。实验分两组:一组细胞培养在Nagata培养液中,另一组培养在RPMI-1640培养液中。初步观察结果如下:     

莲藕根尖染色体制片与免疫荧光染色技术的优化

在细胞遗传学研究中,莲藕根尖染色体制片比较困难,研究了莲藕根尖染色体制片过程中适宜取材的根尖长度、有丝分裂指数、预处理试剂和处理时间、固定时间、酶解与低渗时间等相关因素,并对莲制片进行了免疫荧光染色。结果表明:根尖长为1.5 cm左右时有丝分裂指数最高,预处理采用冰水冷冻处理24 h分裂相较多,染色体形态清晰;用4%多聚甲醛固定1h,染色体形态较好;采用2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶混合液37℃消化30 min,酶解较彻底,细胞质残留少,染色体分散良好;1×PBS低渗30 min,染色体形态较好;免疫荧光染色后经检测可观察到较强的信号。     

严重发热伴血小板减少综合征病毒培养以及病毒滴度检测方法的建立

目的:建立严重发热伴血小板综合征病毒(SFTSV)培养和病毒滴度检测的方法,为其致病机制研究奠定基础。方法:选取生长良好的Vero细胞铺六孔板接种SFTSV,每隔24 h收集培养病毒上清检测SFTSV病毒复制拷贝数,从而选取最佳时间点收获病毒液并用浓缩离心管浓缩病毒液,保存备用。将SFTSV病毒液进行10倍比稀释,每梯度200μL接种生长良好的单层Vero细胞,用3 m L高压灭菌的甲基纤维素-DMEM覆盖物覆盖每孔Vero细胞,约9 d后温和去除甲基纤维素-DMEM覆盖物,经预冷的4%甲醛固定细胞后,用结晶紫染色,PBS洗脱3次,计算空斑数。结果:根据病毒繁殖生长情况,病毒在第4 d后达复制高峰并随后进入平台期,第8天病毒复制开始下降。参照甲基纤维素-结晶紫空斑法实验结果,病毒滴度为6×106PFU/m L。结论:SFTSV病毒培养以及滴度检测方法成功建立,选取4天后收获病毒上清最佳,甲基纤维素-结晶紫空斑法形成的空斑清晰可数。     

分化的骨骼肌细胞的不同固定和化学染色方法比较

该文比较了几种不同固定和化学染色方法对分化的骨骼肌细胞的效果及优缺点,并探讨了用化学染色法进行骨骼肌细胞形态学分析的可行性。骨骼肌前体细胞系C2C12经肌分化诱导3天后分别使用4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)、甲醇(methanol)、卡诺氏(Carnoy)固定液固定5 min、10 min和15 min,以确定最适固定方法;然后分别用改良苯酚品红(modified phenol fuchsin)、吉姆萨(Giemsa)、苏木精–伊红(hematoxylin-eosin,HE)三种不同的染液进行染色。结果表明,4% PFA固定5 min或10 min较其他方法更好地保持了肌管的形态;对于分化的骨骼肌细胞包括形成肌管的细胞和未形成肌管的细胞,HE染色优于其他几种染色方法,但以上几种方法均不如免疫荧光染色方法。     

“观察根尖分生组织细胞的有丝分裂”实验改进综述及思考

"观察根尖分生组织细胞的有丝分裂"在实验教学实践中存在一节课难以完成、效果不佳等问题。综合比较林亮、方春妮等研究者的改进方法,取长补短,通过大量实验总结出一套用1课时就能完成实验且效果较好的改进方法:选择洋葱为实验材料,中午12∶00取根尖,设置对照把握解离时间,在白色点滴板上完成解离、漂洗,将根尖捣碎后用醋酸配制的龙胆紫溶液染色,最后用稍宽于盖玻片的吸水纸包绕3~4圈,用带橡皮的铅笔敲击制成临时装片。     

2003年国际生物学奥林匹克竞赛实验考试试题(2)

2.2根据被子植物花的特征和子房类型,结合下列(1～4)图,写出A、B和C花中子房的类型,并写在答案纸中。2.3请在答案纸中回答,A、B、C花分属于哪科,从下述10个科中挑选。1)毛莨科2)木犀科3)蔷薇科4)豆科,蝶形花科5)壳斗科6)十字花科7)唇形科8)茄科9)菊科10)百合科试题3.植物器官横切片的解剖结构材料和用具1)固定的植物器官12)显微镜13)镊子14)解剖针25)叶片16)载玻片27)盖玻片48)内有间苯三酚的滴瓶19)移液管110)10%盐酸溶液(E试剂瓶)111)蒸馏水(C试剂瓶)1自己制备1片横切片,用间苯三酚染色,加几滴盐酸,2～5min后用水洗,盖上盖玻片,在显微…     

快速显示血细胞及骨髓细胞DNA、RNA的方法

实验对传统的甲绿 派若宁法做了一定的改进 ,使染色时间缩短 ,步骤简化 ,效果良好。并对骨髓和脾造血细胞内ＤＮＡ、ＲＮＡ的定性和定量显示进行了一定的探讨。1.材料和方法1 1　材料 :派若宁Ｙ染液的配制 6%派若宁Ｙ(ＡＭＲＥＳＣＯ分装 ) 1ｍｌ,0 2Ｍ醋酸缓冲液(ｐＨ5 0 ) 8ｍｌ,蒸馏水 8ｍｌ ,优质甘油 1ｍｌ。此过程在磁力搅拌器上进行。 2 %甲绿用 0 1ＭＰＢＳｐＨ7 2溶液配制 ,经三氯甲烷洗脱去影响染色效果的甲紫成分 ,制得较纯的甲绿溶液。1 2　染色方法 :取小鼠股骨 (用ＲＰＭＩ 1640培养液将骨髓冲出 )和脾细胞 ,制成细胞悬液…     

小肠腺三色染色法

我们采用三色染色的方法对小肠肠腺细胞进行染色,杯状细胞、潘氏细胞、胞质和肠腺基膜呈现三种不同的颜色。细胞形态清晰,对比鲜艳,收到了理想效果。材料和方法1·材料人小肠为手术切除新鲜标本。10%甲醛固定24-48h,常规脱水,石蜡包埋。2·方法石蜡切片厚4-6μm,切片脱蜡,蒸馏水洗2m in,复合染液染3-5m in,70%乙醇分色,蒸馏水洗1m in,阿利新蓝染5m in,蒸馏水轻洗;0·2%光绿复染胞质、肠腺基膜20s;70%盐酸乙醇分色;梯度乙醇脱水;二甲苯透明;中性树胶封固。3·染液配制(1)复合染液:1%伊红(1g伊红,70%乙醇100m l)40m l,2%偶氮桃红(2g偶氮桃红甲…     

一种手动解离、免疫磁珠分选加TIC培养液改良的小鼠原代海马小胶质细胞培养法

本文旨在研究手动解离、免疫磁珠分选加TIC培养液改良原代小胶质细胞的培养方法,获得高活性、高纯度且与在体状态更接近的小鼠海马原代小胶质细胞,以用于小胶质细胞的相关研究。选取2～4周龄SPF级C57BL/6J小鼠,PBS灌注后取海马组织剪碎,使用成年鼠脑组织解离试剂盒手动解离海马组织,获得单细胞悬液,再经去碎片试剂去除髓鞘等组织碎片。在4°C孵育CD11b免疫磁珠15 min后,细胞悬液经免疫磁珠细胞分选(magnetic activated cell sorting, MACS)两次过柱提高小胶质细胞纯度。将分选后细胞离心重悬,种在多聚赖氨酸包被后的24孔培养板中,用完全培养基或TIC培养液(以TGF-β、IL-34和胆固醇为主要营养成分的无血清培养基)培养4 d后进行其他检测。结果显示:(1)使用成年鼠脑组织解离试剂盒手动解离可得到含有(56.03±2.10)%活细胞的单细胞悬液;(2)与免疫抗体包被筛选法(immunopanning)相比,经过MACS两步分选后,可得到更多且纯度高达(86.20±0.68)%的小胶质细胞;(3)使用TIC培养液培养4 d后,可获得分枝状、形态类似静息状态的原代小胶质细胞;(4) q RT-PCR检测显示,与完全培养基培养相比,TIC培养液培养的小胶质细胞在4 d和7 d后TNF-α、IL-1β及CCL2 m RNA表达水平更接近急性分离后的小胶质细胞。上述结果提示,采用手动解离海马组织,经MACS两步分选及TIC培养后,可以获得高纯度、高活性且接近在体静息状态的小胶质细胞。     

环孢素A抑制骨水泥颗粒诱导破骨细胞形成及功能

目的:探讨环孢素A对颗粒诱导破骨细胞形成及功能的影响。方法:取SD仔鼠双侧股骨和胫骨的骨髓,以不含血清的α-MEM培养液洗涤并收集骨髓细胞,再将细胞重悬于含10%胎牛血清及10~(-8)mol/L1,25-(OH)_2D_3的α-MEM培养液中,细胞计数后配成1.5×10~7/ml的细胞悬液,加入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)颗粒和不同浓度的环孢素A(10~((-8)mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6) mol/L)于24孔培养板进行培养,并设置阳性对照组(只加PMMA颗粒)和阴性对照组(PMMA颗粒和CsA均不加),每组均有4孔放置骨磨片1片进行培养。培养2周后,行抗酒石酸(TRAP)染色检测破骨细胞形成;骨磨片行甲苯胺蓝染色观察。结果:PM- MA颗粒能够诱导大量TRAP染色阳性的破骨细胞形成,骨磨片有吸收陷窝形成;用环孢素A(10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L)和PMMA颗粒共同培养下TRAP染色阳性的破骨细胞形成数量明显减少,环孢素A浓度达到10~(-6)mol/L时无TRAP染色阳性的破骨细胞形成;环孢素A浓度在(10~(-8)mol/L、10~(-7)mol/L)时骨磨片有吸收陷窝形成,但少于阳性对照组,在10~(-6)mol/L时骨磨片则无吸收陷窝的形成。结论:环孢素A对PMMA颗粒诱导的破骨细胞的形成有着明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

一种用于染色体观察的改良绒毛细胞直接制备法

为弥补羊水检查时间过晚之不足,1984年 Simoni利用绒毛标本直接制备法观察染色体获 得成功,此后,即日益为人们所注目。我们改良 了绒毛细胞直接制备方法,以胶原酶代替乙酸 处理,对绒毛细胞直接制备法（简称乙酸法）和 改良法（简称胶原酶法）进行了比较。大致过程 如下： 取妊娠6-7周人流绒毛组织50mg左 右,严格挑选后,生理盐水洗净,移人含最终浓 度0.5,ug/ ml秋水仙素的RPMI 1640培养液中 孵育1小时（pH7.2, 370C),然后分成两份。一 份按乙酸处理法进行制片：(1)去除培养液,加 3m11.5外拘椽酸钠溶液低渗15分钟;(2）加人 数滴3:1的甲醇：冰乙酸预固定10分钟;(3）吸 弃固定液,重复固定巧分钟;(4)吸弃固定液, 加入1m160并乙酸水溶液,处理2分钟,即追加 纯甲醇2ml; (5)吸取细胞悬液于离心管内离心 (1500-1800rpm); (6）冰水滴片,风干,Giemsa 染色。另一份按改良的胶原酶法制备染色体,大 致如下：(1)弃培养液加人15ng/ml胶原酶4ml, 孵育15-20分钟（370C); (2）加人4m1生理盐 水,离心（1000rpm),分钟,弃上清液,经0.75% 氯化钾4 ml低渗20分钟（370C),用甲醇冰醋 酸固定液lml预固定后,依上法离心,弃上清 液;(3）甲醇冰醋酸（3:1)重复固定15分钟,混 匀后自然沉降,吸上层细胞悬液离心,如此重复 二次后,再固定15分钟,气干法制片。28例实 验结果见表1,无论是可数分裂相,还是完整分 裂相出现率,胶原酶法均比乙酸法为高,二者间 有显著差异。