三种固定液对两种氧化应激细胞模型Bclin1和LC3蛋白免疫荧光染色的影响

摘要 目的：比较采用三种不同的固定液对两种氧化应激细胞模型Beclin1和LC3蛋白免疫荧光染色的影响。方法：本研究使用丙酮/甲醇（1:1）固定液、甲醇固定液和4%多聚甲醛三种固定液分别对氧化应激细胞模型大鼠原代心肌成纤维细胞和MCF-7乳腺癌细胞株进行固定,然后再分别进行免疫荧光双染实验,对比三种固定液固定后对自噬关键调控蛋白Beclin1和LC3染色效果。结果：三种固定液对氧化应激细胞模型Beclin1和LC3蛋白免疫荧光染色结果存在较大差异。丙酮/甲醇（1:1）固定液固定后免疫荧光染色效果最佳,细胞结构清晰可见,两种蛋白定位表达清晰,甲醇固定液次之,4%多聚甲醛固定液效果欠佳。结论：在对大鼠原代心肌成纤维细胞和MCF-7乳腺癌细胞进行自噬相关蛋白免疫荧光双染色实验中,在使用其它固定液染色效果不佳的情况下,可以选择应用丙酮/甲醇（1:1）固定液固定,再进行免疫荧光染色;根据不同实验需求相应选择更适宜的固定液,以达到最佳的荧光染色结果。     

INTU-siRNA质粒的构建及在人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞中的筛选

目的：构建人源靶向特异INTU-si RNA质粒,转染人源性甲状腺Nthy-ori-3-1细胞以构建INTU基因沉默的Nthy-ori-3-1细胞模型,为探索Graves病的发病机制提供合适的细胞模型。方法：构建四对人源INTU序列（编号分别为INTU-29、INTU-31、INTU-33、INTU-35）si RNA质粒和空载体质粒,将空载体和四对INTU-si RNA质粒分别转染Nthy-ori-3-1细胞培养24 h,通过倒置荧光显微镜观察质粒转染细胞后的荧光表达,使用多功能酶标仪检测荧光强度,通过荧光定量PCR法验证INTU基因的沉默效率,通过蛋白质免疫印迹法验证各组细胞内INTU蛋白的表达水平,筛选沉默INTU基因效率最佳的质粒。结果：空载体和INTU-si RNA质粒转染入Nthy-ori-3-1细胞24 h后,倒置荧光显微镜和荧光酶标仪检测结果显示空载体和四组INTU-si RNA组呈现绿色的荧光表达,与正常组相比,空载体与四组INTU-si RNA组的荧光强度均显著高于正常组（P<0.01）,提示质粒均转染成功。荧光定量PCR结果显示,与正常组和空载体组相比,四组...     

Xpert MTB/RIF在人类免疫缺陷病毒感染/艾滋病患者中诊断结核病的价值

为探讨利福平耐药结核分枝杆菌实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mycobacterium tuberculosis/rifampicin,Xpert MTB/RIF)在人类免疫缺陷病毒感染/艾滋病(human immunodeficiency virus infection/acquired immunodeficiency syndrome,HIV/AIDS)患者中诊断结核病的价值,本研究回顾性分析了2018年1月1日—2020年12月31日复旦大学附属公共卫生临床中心感染与免疫科收治的801例HIV/AIDS合并疑似结核病患者的临床资料。801例患者中,657例进行了Xpert MTB/RIF、外周血结核感染T细胞斑点试验(tuberculosis T cell spot test,T-SPOT.TB)、抗酸染色涂片镜检和BACTEC MGIT 960液体培养等检测。以液体培养及菌型鉴定结果作为结核病诊断的“金标准”,确诊结核病92例,Xpert MTB/RIF、T-SPOT.TB、抗酸染色涂片镜检在HIV/AIDS患者中诊断结核病(包括肺结核和肺外结核)的灵敏度分别为72.8%、55.4%和69.6%,特异度分别为96.8%、90.3%和84.4%,与“金标准”行一致性检验,Kappa值分别为0.719 (P<0.01)、0.430(P<0.01)和0.424(P<0.01)。Xpert MTB/RIF检测502份呼吸道样本,结果显示其诊断肺结核的灵敏度和特异度分别为66.7%和96.0%;在痰涂片阳性和阴性的患者中,Xpert MTB/RIF诊断肺结核的灵敏度分别为77.4%和35.2%,特异度分别为87.7%和 97.8%。采用Xpert MTB/RIF检测343份肺外标本,结果显示其诊断肺外结核的灵敏度和特异度分别为63.3%和95.2%。以上结果提示,Xpert MTB/RIF在HIV/AIDS患者中诊断结核病(包括肺结核和肺外结核)具有较高的灵敏度和特异度,诊断肺结核的灵敏度高于肺外结核,因此推荐将其作为HIV/AIDS患者疑似结核病的首选检测方法。     

低浓度乙醇对糖尿病大鼠心肌损伤后线粒体融合素2表达的影响

目的：探讨低浓度乙醇对糖尿病大鼠心肌损伤后线粒体融合素2（mfn2）表达的影响。方法：糖尿病大鼠模型采用链脲佐菌素55 mg/kg腹腔注射,分为正常对照组（Control组）,糖尿病组（DM组）和糖尿病+乙醇组（DM+EtOH组）（n=6）;糖尿病+乙醇组于造模成功1周后给予2.5%乙醇日常饮用,1周后改为5%的乙醇持续至8周,8周后行离体心脏灌流,测定心室血流动力学指标,应用自动生化分析仪测定血清乳酸脱氢酶（LDH）和天门冬氨酸转移酶（AST）的水平。Western blot测定左心室组织线粒体融合素2（mfn2）蛋白表达,免疫组化测定心肌组织mfn2蛋白表达。结果：与control组大鼠心肌相比,DM组大鼠心率、左室发展压、左室做功下降,左室舒张末压抬高,血清LDH及AST升高明显,心室mfn2蛋白表达降低;与DM组大鼠心肌相比,DM+EtOH组明显促进心率、左室发展压、左室做功的恢复,降低左室舒张末压,同时降低LDH的水平和AST的释放,mfn2的蛋白表达增高。结论：糖尿病大鼠心肌损伤时,心肌mfn2表达降低;低浓度乙醇增强mfn2在心肌组织中的表达,提示mfn2的增加可能参与低浓度乙醇对糖尿病诱发的心肌损伤的保护作用。