一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌的分离与鉴定

自芝麻香型白酒高温大曲中分离到一株嗜热放线菌Zm60,对其进行形态学、生理生化代谢特征鉴定、化学成分分析以及细胞代谢酶活性测定,并结合16S rRNA基因序列分子生物学鉴定及系统发育学分析,结果表明,该菌株归属于高温放线菌属(Thermoactinomyces sp.),并且可鉴定为普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris).其最适生长温度为55℃,细胞壁肽聚糖及氨基酸分别为meso-DAP及Ala、Glu,醌为MK-7,主要脂肪酸组成分别为iso-C15∶0(44.01％)、anteiso-C15∶0(22.23％)、iso-C17∶0(14.16％)、anteiso-C17∶0(7.56％)和iso-C16∶0(6.18％),具有碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶的活性.该菌株是首次从我国芝麻香型白酒高温大曲中分离并鉴定得到的高温放线菌.     

胶质类芽胞杆菌PCR快速检测方法

摘要:【目的】胶质类芽胞杆菌(Paenibacillus mucilaginosus) 是微生物肥料广泛应用的功能菌种之一,筛选并鉴定其特异性引物,建立该菌种快速检测方法,对微生物肥料产品检测和评价至关重要。【方法】本文筛选了胶质类芽胞杆菌基因间的一段非编码序列作为特异性引物(orf06701-F:5'-ATGGAGGAAACATGGGGTGA-3'/orf06701-R: 5'-TCAGGAATGAAGGCCCCCTT-3'),通过PCR 反应条件/ 体系的优化、特异性及灵敏度检测,建立了胶质类芽胞杆菌     

高温大曲中地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis CGMCC 3963)的耐高温特征

【目的】高温大曲的使用是中国酱香型白酒酿造的特征之一,耐高温的细菌是高温大曲中重要的优势功能菌,它们对酱香型白酒的酿造具有重要的价值。研究高温大曲中细菌的耐高温特征对于认识酱香型白酒的酿造特征具有一定的作用。【方法】本文以中国白酒高温大曲中筛选获得的一株具有自主知识产权的耐高温功能细菌地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC 3963为对象,测定其耐高温特征,并首次通过细胞形态学的分析,以及转录组学等技术的应用系统研究了B.licheniformis CGMCC 3963的耐高温机制。【结果】地衣芽胞杆菌B.licheniformis CGMCC 3963能够耐受55℃高温生长。在高温条件下,该菌仍具有较旺盛的代谢生长能力,且产生大量荚膜,同时大量I类热休克蛋白基因以及聚谷氨酸合成基因的表达水平均得到明显提高。【结论】B.licheniformis CGMCC 3963在高温下,I类热休克蛋白以及以聚谷氨酸为主要成分的荚膜大量产生,对功能细菌耐高温具有重要的作用。该结果首次从分子水平认识了中国白酒酿造微生物的耐高温特征,丰富了白酒酿造微生物学的科学理论。     

利用PCR-DGGE未培养技术对中国白酒高温和中温大曲细菌群落结构的分析

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究了5种高温和中温白酒大曲细菌群落结构,通过优势条带切胶鉴定确定了大曲中优势细菌种属信息。结果表明,Weissella cibaria、Lactobacillus helveticus、L.fermentum、L.panis等乳酸菌普遍存在于5种大曲中,Ther-moactinomyces sanguinis仅存在于高温曲酱曲中,同时DGGE检测到了传统方法未能分离鉴定的Staphylococcus xylosus、Klebsiella oxytoca。不同工艺大曲细菌群落结构存在明显差异,随着制曲温度的升高,大曲细菌多样性指数有下降趋势。PCR-DGGE技术是一种能够快速有效地研究白酒大曲细菌群落结构的技术。     

肠道中乳酸杆菌属特异性定量引物的筛选及验证

【目的】乳酸杆菌与人和动物的健康有密切关系,它的存在及含量变化可以作为评价宿主健康的指标之一。在乳酸杆菌定量研究中,特异性引物往往是定量成功的关键。然而,已有引物质量参差不齐,难以保证其特异性。本文旨在通过理论与试验的方法快速筛选出用于定量的乳酸杆菌属特异性引物,同时为今后引物筛选和设计提供理论基础。【方法】查阅文献、挑选出12对基于16S rRNA基因序列设计的乳酸杆菌属引物,通过MEGA 6.0软件确定引物相对位置,计算引物匹配率,以引物相对位置和匹配率为依据重新组合引物,获得理论特异性乳酸杆菌属引物,再通过琼脂糖凝胶电泳和QX200Droplet Digital PCR系统对新组合引物的特异性进行检验。【结果】通过理论与试验相结合的方法确定了一对特异性较好的乳酸杆菌属定量引物Lab1,它的扩增产物大小约300 bp。ddPCR系统检验结果发现其特异性和灵敏性较好,还可以有效定量粪便中的乳酸杆菌。【结论】引物设计理论结合特异性试验这种方法可以快速有效地筛选出特异性较好的引物,同时为今后引物筛选和设计提供理论基础。     

大曲来源淀粉利用型乳酸菌的筛选及其淀粉利用特性

【背景】乳酸菌是面包、馒头等发酵食品中的重要功能微生物,对改善质地和风味均具有重要作用。淀粉利用能力高的乳酸菌,因其能够在生面粉中更好地定殖而具有重要的应用价值。【目的】筛选获得淀粉水解型乳酸菌并研究其淀粉利用特性。【方法】以浓香型白酒大曲为筛选源,采用淀粉基质碳源对大曲中乳酸菌进行定向富集,结合淀粉发酵能力筛选高淀粉利用能力菌株,并对筛选得到的优良菌株展开淀粉酶表达及其酶活力研究。【结果】以贮存3-6个月的大曲为优秀筛选源,以生面糊传代富集方法可较快筛选出具有良好淀粉利用能力的乳杆菌,主要物种为植物乳杆菌和类食品乳杆菌。对其中一株具有淀粉利用能力的类食品乳杆菌LBM12001的淀粉水解特征和淀粉酶活力展开研究,该菌株淀粉水解能力达10 g/L,并且其在面糊中具有良好的定殖能力;酶活力测定表明,其α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶为胞外酶;麦芽糖淀粉酶水解淀粉的最适pH值为3.5,比酶活为1 240 U/mg。【结论】建立起从我国传统白酒发酵大曲中高效筛选淀粉水解型乳酸菌的富集筛选方法,以及菌株的水解能力评价方法,获得的胞外麦芽糖淀粉酶分泌型乳杆菌在酸面团、馒头等需进行生面粉发酵食品的生产中具有重要应用前景。     

环保微生物菌剂常用5种芽胞杆菌的PCR鉴定

枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、地表芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）、巨大芽胞杆菌（Bacillus megate．rium）、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）、环状芽胞杆菌（Bacillu scirculans）是5种环保微生物菌剂中常用的芽胞杆菌,我国每年有大量此类菌剂进口。针对这些菌的传统理化检测方法费时费力,检测部门急需建立一种快速、准确的检测方法。利用GenBank上已有gyrB、rpoB、gdh基因序列分别设计和筛选上述菌种的特异性引物,经优化建立PCR检测方法。结果显示,使用所设计的特异引物,每种茼均扩增得到特异单1条带,能准确鉴定上述菌种并且与其他对照芽胞杆菌及非芽胞杆菌无交叉反应,送检样品的PCR检测结果与常规方法检测结果一致。建立的特异PCR方法具有良好的重复性和准确性,可快速鉴定上述菌种,具有很好的推广应用前景。     

食品中阪崎肠杆菌快速检测鉴定方法的研究

通过设计特异性的引物,采用SYBR Green I实时荧光PCR,经引物的优化筛选、特异性和重现性试验,以及模拟污染样品检验,建立了食品中阪崎肠杆菌的快速检测和鉴定方法。     

西瓜枯萎病菌的快速检测与鉴定

通过西瓜枯萎病菌与其他专化型枯萎病菌及瓜类几种重要病原菌的比较基因组分析,获得了西瓜枯萎病菌的基因组特异序列。在此基础上,设计出特异引物,筛选可扩增出西瓜枯萎病菌特异性DNA条带的引物。将特异性引物和尖孢镰刀菌专化型的通用引物W106R/W106S结合,建立双重PCR检测体系。该双重PCR检测体系可以在一次PCR反应中快速、准确的检测出西瓜枯萎病菌,为通过分子方法快速鉴定西瓜枯萎病菌提供技术支持。     

邳州银杏内生放线菌分离、筛选及活性菌株鉴定

【目的】从银杏中分离、筛选得到具有抑菌作用的内生放线菌,为放线菌在生物防治上的应用提供新的菌种资源。【方法】采用组织贴片培养法进行分离,生长对峙法进行筛选。【结果】从银杏的根、茎、叶中分离得到98株、50株、8株内生放线菌(共计156株),47株放线菌具有拮抗植物病原真菌活性。菌株KLBMP 5501抗菌活性最好且具有广谱性,基于形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列的相似性分析等多项分类特征表明,菌株KLBMP 5501是一株浅紫链霉菌(Streptomyces violascens)。【结论】筛选得到了具有应用潜力的高活性菌株,并进行了菌种鉴定。     

实时荧光定量PCR检测金山醋酸乳杆菌的方法与应用

[目的] 建立基于实时荧光定量PCR （RT-qPCR）的金山醋酸乳杆菌特异性检测方法,并将其应用于食醋和白酒发酵过程样品的快速检测。[方法] 筛选金山醋酸乳杆菌基因组中特异性强的基因序列作为模板设计特异性引物,通过标准菌株、醋醅样品进行PCR验证引物的特异性和准确性,建立RT-qPCR方法分析金山醋酸乳杆菌在不同地区酒醅、醋醅和食醋样品中的含量。[结果] 以金山醋酸乳杆菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基（编码pheS基因）为参考序列,设计了一对GC含量55%、T_m值59℃、可扩增199 bp片段的引物。建立的RT-qPCR方法特异性强、灵敏度高且重复性好,检测浓度范围为2.24-10.24 lg （copies/μL）,成功应用于4个地区的酒醅、醋醅和食醋样品检测。对镇江香醋醋酸发酵过程的研究表明,醋醅中的金山醋酸乳杆菌数量先迅速增加,随后稳定在10⁸ copies/g干醅。[结论] 本研究建立的RT-qPCR方法可对食醋和白酒发酵过程中金山醋酸乳杆菌进行特异性鉴定和快速定量。     

一种快速定量检测益生菌制品中植物乳杆菌的方法

目的建立快速定量检测植物乳杆菌的方法,排除近缘菌的干扰。方法利用SMM系统筛选植物乳杆菌种特异序列,根据特异序列设计引物进行实时荧光定量PCR反应。结果设计的引物具有良好的种特异性,检测限为2．26×10^2CFU／mL。结论该方法快速灵敏,可以在实际生产中应用。     

一株芝麻香型白酒高温大曲的施莱格尔氏菌的分离与鉴定

从芝麻香型白酒高温大曲中分离到一株革兰氏阴性高温细菌Zm91,并对其进行形态学、生理生化代谢特征以及细胞代谢酶活性和药物敏感性分析,结合16S rRNA基因序列分析结果,Zm91鉴定为水生施莱格尔氏菌(Schlegelella aquatica).该菌株是首次从我国芝麻香型白酒高温大曲中分离得到的施莱格尔氏菌,其G+C mol％含量为67.5％,具有碱性磷酸盐酶、酯酶(C4)、脂酯酶(C8)、白氨酸芳胺酶、颉氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶及α葡萄糖苷酶活性,对青霉素、氨苄西林、链霉素、利福平敏感.     

基于比较基因组学的高地芽孢杆菌6ww6分子标识筛选及其快速鉴定

【目的】高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis) 6ww6是一株根际耐盐促生菌,可以作为微生物肥料的优选菌种。为了加强菌种知识产权保护,建立菌株快速检测方法。【方法】本研究通过基因组比对分析、TBLASTn检索、NR库检索验证并剔除有其他同源的结果序列,最终得到菌株6ww6的孤儿基因,设计引物进行PCR鉴定。【结果】筛选出5个特异性基因J939_13195、J9319_05960、J9319_13355、J9319_05965和J9319_13350。引物5960F和5960R可以单一性扩增出菌株6ww6的目的基因J9319_05960,确定其为菌株6ww6的特异性分子标识。【结论】本研究确定了菌株6ww6的唯一性身份编码,建立了以比较基因组学和孤儿基因为基础的菌株水平上的鉴定方法。该方法具有快速、精确、能鉴定到菌株水平的优点,对于有价值微生物的知识产权保护提供了有力的抓手。     

基于三步荧光定量PCR技术揭示不同产区白酒酿造系统中Lactobacillus sp.的分布特征

[背景]Lactobacillus sp.是一株存在于白酒酿造系统中的功能微生物,但是针对Lactobacillus sp.的定量方法及其在中国白酒酿造系统中的分布尚未被研究。[目的]建立一种基于特异性引物的荧光定量PCR定量方法,并应用于实际生产检测,揭示Lactobacillus sp.在中国白酒酿造系统中的分布特征。[方法]基于16S rRNA基因序列设计特异性引物,并通过PCR验证引物特异性;优化荧光定量PCR反应程序,提高引物扩增效率;定量分析所采集样本中Lactobacillus sp.的含量,揭示Lactobacillus sp.在中国白酒酿造系统中的分布特征。[结果]设计了一对扩增产物大小为445 bp的特异性引物。通过优化扩增条件,构建含有变性、退火、延伸过程的三步荧光定量PCR方法,该方法扩增线性较强,R^2>0.99;灵敏度高,定量限为17.9 copies/μL;重复性好,Ct值的变异系数小于1%。跟踪检测全国10个产区代表产地的白酒酿造系统,其中8个产区均检测到Lactobacillus sp.,在相同产地不同酿造工艺的酿造系统中均检测到Lactobacillus sp.,但是含量上有显著差异。山东潍坊产地的芝麻香型白酒发酵体系含量最高(7.27±0.04 lgcopies/g),跟踪发酵时间样本发现Lactobacillus sp.的生长分为两个阶段:生长期(0-15 d)和稳定期(15-45 d)。[结论]基于特异性引物所建立的三步荧光定量PCR技术可实现对白酒酿造系统中Lactobacillus sp.的鉴定和定量,通过跟踪检测发现Lactobacillus sp.广泛分布在中国白酒发酵体系中,其中产地决定Lactobacillus sp.的分布,酿造工艺影响含量,在发酵过程中Lactobacillus sp.的含量具有明显的动态变化规律,为进一步研究该菌在发酵过程中的功能提供参考。     

大曲贮存过程中原核微生物群落结构及风味成分演替规律

【目的】研究大曲贮存过程中原核微生物群落结构及风味成分变化规律,阐述大曲贮存阶段的必要性和重要性,并探索不同微生物种属之间的相互关系,为更好地控制大曲品质提供微生物和风味方面的参考依据。【方法】通过Mi Seq高通量测序剖析大曲成熟过程中原核微生物群落结构变化;利用共存(Co-occurrence)模式方法分析不同种属微生物之间的相关关系,预测其相关性;利用SPME-GC-MS分析贮存过程中大曲风味成分的变化规律。【结果】采用Mi Seq测序方法共得到3 710个OTUs,除不能有效比对的序列外共鉴定出29个门和160个种属。其中,乳杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、高温放线菌属、乳球菌属等是大曲中的优势菌群。随大曲贮存时间推移,贮存前期不断积累酸、醇类物质,后期酯类及含氮类等重要风味物质不断形成,而4-甲基苯酚等异味物质的含量却不断降低。相关性分析结果表明,乳酸菌与乳酸、乙酸等酸类物质之间存在显著的相关性,芽孢杆菌与酸类及含氮化合物之间存在显著的相关性。【结论】大曲贮存过程中,原核微生物结构不断发生调整,风味物质向更优质白酒风味进行变化。除环境因素外,原核微生物的代谢活动对风味物质的形成具有重要的影响,因此大曲贮存是白酒酿造过程中必不可少的环节。     

基于环介导等温扩增技术对人乳头瘤病毒的分型检测

目的:利用环介导等温扩增技术(LAMP)对人乳头瘤病毒(HPV)进行快速分型检测。方法:以HPV59、HPV66和HPV68等3种病毒亚型为实验对象,选择合适的特异性核酸序列作为检测的靶序列并构建质粒,针对每个待检靶序列设计若干组扩增引物,并利用构建的质粒筛选出特异性强、灵敏度高的引物组合;将筛选成功的引物加至微流控芯片上,实现人宫颈脱落上皮细胞样本内HPV的快速核酸分型检测。结果:针对HPV59、HPV66和HPV68这3种病毒亚型,设计筛选出具有一定灵敏度的特异性引物,结合微流控芯片,无需对样本进行复杂的核酸提取纯化操作,实现了对临床样本的直接快速检测,整个检测过程在1.5 h内即可完成。结论:LAMP技术可用于临床样本中HPV的分型检测,与微流控芯片结合后操作简单、检测时间短,在临床上有较好的应用前景。     

实时定量聚合酶螺旋反应定量检测变形链球菌方法的建立

目的:建立实时定量检测口腔内变形链球菌的实时定量聚合酶螺旋反应(PSR)方法。方法:针对变形链球菌的gtf B基因设计4套引物,通过实时浊度法和显色法两种方法判断结果。结果:从4套引物中筛选出最佳引物,并确定最佳温度为65℃;进一步实验表明采用最佳引物能特异性地检测变形链球菌,与13种其他病原核酸无交叉反应,敏感性达10拷贝/μL。结论:建立了实时定量检测变形链球菌的PSR方法,该方法具有简单快速、特异性强、敏感性高的特点,为实时定量检测变形链球菌提供了新技术。     

马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫SCAR标记的建立及应用

为了探索快速鉴定马铃薯瓢虫Henosepilachna vigintioctomaculata(Motschulsky)和茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata(Fabricius)的分子生物学方法,本研究在随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)的基础上,分别设计了可以鉴别两个物种的序列特征扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)标记。从随机合成的60条引物中筛选出来2条特异性引物(分别为OPI-6和OPJ-15),引物OPI-6在马铃薯瓢虫中扩增出约750 bp的特异性条带,引物OPJ-15在茄二十八星中扩增出约750 bp的特异性条带,根据测序结果设计了两对SCAR引物对筛选结果进行验证,发现根据OPI-6的测序结果所设计的SCAR引物(OPI-6 test)仅能在马铃薯瓢虫中扩增出645 bp的条带,而根据OPJ-15的测序结果所设计的SCAR引物(OPJ-15 test)仅能在茄二十八星瓢虫中扩增出436 bp的条带。这两对SCAR引物能够准确、稳定且快速地区分马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫,对这两种害虫的精准防控具有重要意义。     

永兴岛白穗软珊瑚共附生放线菌筛选及部分活性次级代谢产物的鉴定

【目的】从白穗软珊瑚中分离和鉴定共附生放线菌,运用PCR技术对所分离的放线菌进行I型聚酮合酶(PKS)筛选,研究其次级代谢产物。【方法】使用11种培养基对白穗软珊瑚共附生放线菌进行分离、鉴定,构建16S rRNA基因系统发育进化树,以基于I型PKS的KS基因设计的简并引物对所分离放线菌进行基因筛选,对阳性菌株用3种培养基发酵检测,对目标菌株进行放大规模发酵分离鉴定次级代谢产物。【结果】从白穗软珊瑚中分离到20株共附生放线菌,包括链霉菌属10株、迪茨氏菌属2株和盐水孢菌属8株,筛选获得18株I型PKS阳性菌株,并从菌株Salinospora arenicola SH04中分离到化合物rifamycin S和rifamycin W。【结论】首次从珊瑚共附生环境中分离得到海洋专属性稀有放线菌盐水孢菌属,并以I型PKS基因筛选为指导,分离鉴定了聚酮类化合物rifamycins,为研究软珊瑚共附生可培养放线菌的多样性和基于基因筛选指导分离次级代谢产物提供了可靠依据。