属特异性T-RFLP技术用于乳酸杆菌的群落分析

【目的】设计乳酸杆菌属特异性T-RFLP技术(末端限制性片段长度多态性分析)对14株乳酸杆菌进行分型。【方法】采用源于16S-23S rRNA基因间隔区序列的乳酸杆菌属特异性引物LAB-rev,乳酸杆菌的属特异性引物,6-FAM荧光标记后结合16S上游通用引物7f用于乳酸杆菌的PCR扩增。【结果】选取HaeⅢ和HhaⅠ进行限制性酶切,最后对酶切后的产物末端测序得到T-RFLP峰谱图,该图谱能够快速准确地对不同种的乳酸杆菌进行定性、定量的分析。【结论】实验成功搭建T-RFLP技术用于微生态环境中乳酸杆菌检测的平台,对于在功能性食品、乳酸饮料和药物对肠道微生态的影响及菌种鉴定等领域有重大意义。     

双歧杆菌属特异性定量引物的设计及验证

【目的】旨在设计一对双歧杆菌属特异性引物以检测不同样品中低丰度双歧杆菌的含量。【方法】在NCBI中下载57株双歧杆菌全基因组序列,以其共有单拷贝核心基因为目的片段设计双歧杆菌属特异性引物;并对引物进行PCR初筛和特异性复筛;之后借助ddPCR(Droplet Digital PCR,微滴式数字PCR)依次对筛选出的引物进行特异性、灵敏度和实用性验证。【结果】引物Bif-D-9特异性最好,可扩增出4株双歧杆菌而不能扩增20株非双歧杆菌中的任何一株菌;同时通过ddPCR仪定量稀释后的DNA,其扩增结果呈线性下降趋势,证明其灵敏度较好;另外,Bif-D-9结合ddPCR定量出婴儿粪便中双歧杆菌的拷贝数为71 copies/μL,母亲粪便中双歧杆菌的拷贝数为2.7 copies/μL,证明了该方法的实用性。【结论】引物Bif-D-9具有双歧杆菌属特异性,且灵敏度较高、实用性较好,适用于复杂样品中双歧杆菌属定量。     

用PCR法快速半定量阴道分泌物中的乳酸杆菌

目的 通过对PCR引物、反应条件及样本处理条件的摸索,建立一种不经过分离培养和DNA提取纯化步骤,直接用乳酸杆菌特异性引物快速定性、半定量妇女阴道分泌物标本中乳酸杆菌的方法.方法 设计乳酸杆菌属特异性引物;对样本处理方法和PCR反应条件进行摸索;比较用PCR法定量阴道分泌物中乳酸杆菌的结果和稀释滴种法定量结果的相关性.结果 （1）用浓度为2%的Tritonx-100处理阴道标本后可在220 bp的位置得到最佳的特异性扩增区带;（2）将MgCl2在PCR反应体系中的终浓度调节至2.5 mmol/L时,可以产生最强的特异性反应扩增带;（3）用PCR法分析阴道分泌物所得菌数与培养所得菌数之间明显相关（P＜0.05）;用PCR法分析阴道分泌物所得灰度值与培养所得菌数之间明显相关（P＜0.05）.结论 将阴道分泌物标本经过简单的离心、洗涤处理后,直接应用PCR法,就可以快速地定性和半定量妇女阴道分泌物标本中的乳酸杆菌.     

添加有扩增内标的沙门氏菌荧光定量PCR 检测体系的建立与评价

【目的】建立添加有扩增内标(IAC,Internal amplification control)的沙门氏菌EvaGreen荧光定量PCR检测体系,提高PCR检测可靠性。【方法】通过比较已有沙门氏菌属细菌的基因组序列,筛选沙门氏菌属特异检测靶点,设计特异引物;再用复合引物法构建扩增内标,优化参数,建立沙门氏菌内标PCR检测体系,利用特异性和灵敏度实验评价体系的检测性能。【结果】筛选得到的新特异靶点基因编码III型分泌系统蛋白(ssaQ)。针对该基因设计特异引物(SsaQ6),建立了添加有扩增内标的常规PCR和EvaGreen荧光定量PCR检测体系;二者对151株沙门氏菌和34株非沙门氏菌的检测符合率均达100%,对基因组DNA的检测下限达14.9拷贝/PCR和2.76拷贝/PCR;人工污染牛奶样品(初始染菌量:4-6 cfu/10 mL),増菌10 h和8 h后分别可检出沙门氏菌。【结论】本研究发掘的新靶点基因ssaQ特异性强,基于这一新靶点建立的添加有扩增内标的EvaGreen荧光定量PCR比常规内标PCR的检测限更低,重复性更好,快速方便,在12 h内即可得出检测结果,并且定量准确,有利于推进沙门氏菌PCR检测方法的标准化应用。     

双歧杆菌属特异性测序引物筛选及优化

【背景】目前双歧杆菌的益生功能被普遍认可,越来越多的研究开始关注肠道中双歧杆菌的生物多样性。然而双歧杆菌是肠道中的低丰度物种,现有技术尚难以深入研究其多样性。【目的】基于双歧杆菌16SrRNA基因序列筛选一对适用于分析粪便样品中低丰度双歧杆菌属多样性的特异性引物。【方法】依据已有引物的相对位置及其与双歧杆菌属16S rRNA基因序列的匹配率,将引物重组优化得到扩增片段800 bp的双歧杆菌属特异性引物;通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行实验筛选和特异性验证;以细菌通用引物(27f/1492r)为参照,通过单分子实时(Single-molecule real-time,SMRT)测序技术对不同引物的3份粪便样品中细菌的DNA扩增子进行测序,在种水平上分析比较不同引物的优劣。【结果】对文献中已有的9对双歧杆菌特异性引物进行重组并优化,其中2对引物的理论特异性较好且扩增产物大于800 bp,它们分别为Bif164-f/Pbi R2和Pbi F1/Pbi R2。PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验发现,Bif164-f/Pbi R2的扩增条带明亮且无拖尾。此外,利用SMRT测序平台对引物27f/1492r和Bif164-f/Pbi R2的3份粪便样品中细菌的DNA扩增子进行测序并分析。27f/1492r扩增子的分析结果显示,3份样品依次分别含1、3、4个双歧杆菌种且双歧杆菌的平均相对含量为0.34%;而Bif164-f/Pbi R2扩增子的分析结果显示,3份样品依次分别含2、6和8个双歧杆菌种且双歧杆菌的平均相对含量为98.72%。上述结果表明,Bif164-f/Pbi R2可在种水平上特异地检出粪便中低丰度的双歧杆菌,进而实现样品中双歧杆菌的多样性分析。【结论】筛选出一对双歧杆菌特异性引物Bif164-f/PbiR2,可在种水平上分析粪便样品中低丰度双歧杆菌的生物多样性,同时也验证了理论结合实验进行引物筛选这种方法的可行性。     

应用特异PCR快速鉴定微生物肥料中4种乳酸菌

【目的】植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和德氏乳杆菌(L.delbrueckii)是微生物肥料生产中常用的乳酸菌,它们表型特征相似,若采用传统方法鉴定则费时费力,为准确、快速地鉴定这些种,建立种特异PCR方法。【方法】利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具),以GenBank数据库中上述菌种的recA和gyrB为靶基因,设计和筛选种特异性引物从而建立相应特异PCR鉴定方法。【结果】经过乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)7个属24个种共40株标准菌株的实验验证,4个目标种分别扩增出唯一的目的产物,而其他种均无目的扩增产物。采用建立的4种特异PCR方法对产品中分离的16株乳杆菌进行鉴定,结果与16S rDNA序列分析、Biolog鉴定结果一致。【结论】建立的特异PCR鉴定方法均具有较高的种内通用性和种间特异性,可快速、准确的用于微生物制剂中植物乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌的检测和鉴定,具有较好的应用前景。     

食品中阪崎肠杆菌快速检测鉴定方法的研究

通过设计特异性的引物,采用SYBR Green I实时荧光PCR,经引物的优化筛选、特异性和重现性试验,以及模拟污染样品检验,建立了食品中阪崎肠杆菌的快速检测和鉴定方法。     

转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。【方法】利用实时荧光PCR技术,根据转基因棉花MON88701品系特异性序列设计引物和探针,建立转基因棉花MON88701实时荧光PCR检测方法,并测定本方法的灵敏度、特异性及可重复性。【结果】建立的检测方法特异于转基因棉花MON88701成分的检测,灵敏度测试表明其定量下限为34拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。【结论】本研究建立的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法具有良好的特异性和高灵敏度,适合对转基因棉花MON88701品系进行检测。     

属特异性T-RFLP技术在双歧杆菌群落分析中的应用

【目的】以双歧杆菌标准菌株为材料,构建双歧杆菌属特异性末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)技术,用于微生物群落中双歧杆菌的特异性分析。【方法】采用16S rRNA基因的双歧杆菌属特异性引物,5′-端用HEX荧光标记,结合通用引物1510r进行双歧杆菌特异性PCR扩增,软件模拟酶切后选取Hae III和Alu I进行限制性酶切,对酶切消化产物的荧光标记末端测序得到T-RFLP峰谱图。同时将该技术与实验室已建立的乳酸杆菌属特异性T-RFLP技术相结合,建立多相T-RFLP技术应用于对市面上益生菌产品的时效性检测。【结果】建立的方法能够快速准确地对不同种的双歧杆菌及合生元产品中的益生菌进行定性或半定量分析。【结论】据此,成功搭建T-RFLP技术用于微生态环境中双歧杆菌的检测,并成功将多相T-RFLP技术用于市售益生菌产品的时效性检测。     

实时荧光定量TaqMan-MGB探针法检测杆菌样巴尔通体

【目的】应用Taq Man探针实时荧光定量PCR技术建立特异性强、敏感性高和稳定性好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因,从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较Ct值和荧光强度确定扩增反应的最佳退火温度、探针和引物浓度;将扩增产物连接到p EASY-T载体上制备标准品,绘制标准曲线,分析扩增效率和线性关系;评估方法的特异性、敏感性及重复性。【结果】优化后退火温度为60°C,探针和引物浓度均为200 nmol/L,反应体系20μL。特异性实验显示只有杆菌样巴尔通体扩增出荧光信号,其他种属细菌均未见荧光信号;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率E=98.18%;最低检出限为每个PCR反应3个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.21%–0.42%和0.29%–0.59%,在允许范围内。【结论】研究建立的实时荧光定量Taq Man-MGB探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可快速检测鉴定杆菌样巴尔通体,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。     

基于高通量测序的不同虫态洋虫内共生微生物群落分析

【目的】为分析不同虫态下洋虫内共生微生物菌群组成情况,以成虫和幼虫两种虫态为研究对象。【方法】通过对洋虫内共生微生物提取及高通量测序分析,获得不同样品中微生物组成结构及变化情况。【结果】不同虫态下,随着生长发育的进行,洋虫体内细菌在丰度和多样性两个方面都有很大变化,成虫中的菌群数量相对较少,多样性较幼虫也明显降低。在几种特定微生物组成上不同虫态也存在着较大的差异,成虫中,漫游球菌属和乳酸菌菌属为优势菌属;幼虫体内乳酸菌菌属为优势菌属。真菌变化不明显,孢囊线黑粉酵母菌属为其优势菌属。【结论】研究结果将为后继洋虫生物资源的研究提供相关信息,为洋虫内共生微生物资源开发与利用提供理论依据。     

新疆不同栖息地赤麻鸭肠道菌群多样性研究

【目的】探讨天山北麓赤麻鸭肠道细菌多样性及其与栖息地环境之间的关系。【方法】于2017年秋季在天山北麓5个栖息地随机采取新鲜的赤麻鸭粪便,用细菌16S rDNA通用引物扩增V3–V4区并进行高通量测序,使用BLAST、USEARCH和QIIME等软件和在线工具分析各栖息地样品菌群组成与差异。【结果】从赤麻鸭粪便样本中共获得16S rDNA有效序列408 036条,聚类产生1 014个操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)。样品中的细菌分属25个门和397个属。在门分类阶元上,变形菌门和厚壁菌门在所有样品中均为优势菌,相对丰度较高的还包括拟杆菌门、梭杆菌门、放线菌门、蓝藻细菌、螺旋体门、Saccharibacteria和迷踪菌门,但以上细菌在各栖息地样品中的相对丰度存在差异。在属分类阶元上,各栖息地样品的菌群组成差异显著,艾比湖、安集海水库、奎屯水库、蘑菇湖水库和八一水库样品的优势菌分别为鲸杆菌属、巨单胞菌属、假单胞菌属、乳酸菌属和链球菌属。对不同样品菌群组成和差异分析表明,赤麻鸭胃肠道菌群组成受环境和食源的影响较大。【结论】新疆5个栖息地赤麻鸭肠道...     

犬种布鲁氏菌ZG株单克隆抗体4H3抗原模拟表位的筛选及分析

【背景】目前犬布鲁氏菌病诊断存在一定的困难。【目的】筛选并研究犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株的特异性抗原表位。【方法】利用噬菌体肽库展示技术,以犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株作为靶分子,包被酶标板,用12肽随机肽库经过3轮生物淘洗程序进行筛选。经过3轮筛选后,噬菌体产出率从5.00×10^-7增加到9.84×10^-6,假阳性率逐轮降低。从第3轮筛选的阳性克隆中随机挑取14个进行增殖,提取基因组DNA,进行测序分析;并通过iELISA和cELISA检测阳性克隆的亲和性和特异性。【结果】14株阳性单克隆噬菌体共出现3种不同的短肽序列,分别是KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI和QRIHMRLTTQS;iELISA结果表明3种短肽序列与单克隆抗体的亲和性依次为KMSIRHPIRLPI>ILRRRRKRIIQI>QRIHMRLTTQS;cELISA结果显示短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI特异性较强。对亲和性较强、特异性较高的2条短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI展开具体分析,比对分析表...     

原油污染土壤中生物表面活性剂菌株的筛选和产物鉴定

【目的】从原油污染的土壤中分离出产表面活性剂的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SX-20,并对其产物进行提取及结构分析。【方法】采用氯化十六烷基吡啶和溴百里酚蓝混合溶液(cetylpyridinium chloride-bromothymol blue,CPC-BTB)显色反应结合血琼脂平板简单高效的筛选得到产脂肽的枯草芽孢杆菌。通过酸沉淀、甲醇萃取和旋转蒸发提取发酵所产生的粗产物,该产物对痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)具有良好的抑制作用。运用傅里叶红光变换光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、氨基酸分析和液相质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)对粗产物的成分进行分析。【结果】筛选所得的菌株所产物质是含C15脂肪酸链和7个氨基酸形成的环状的脂肽表面活性剂。【结论】本研究为筛选脂肽类生物表面活性剂提供了一定的理论基础和技术路线,有利于后续获得高产的低成本的生物表面活性剂。     

基于荧光染料Cy5.5标记的引物延伸法鉴定细菌RNA剪切加工位点

【背景】传统引物延伸法常与放射性标记结合使用,但由于放射性元素半衰期短、危害人体健康及严格的操作要求等限制了其在一般实验室的广泛使用。因此,开发新型非放射性引物延伸法成为当前研究的热点。【目的】建立非放射性的引物延伸法,并利用该方法实现对细菌RNA剪切加工位点的鉴定。【方法】将包含RNA剪切位点的序列克隆至双荧光报告系统,然后利用荧光染料Cy5.5标记的特异性靶向mcherry寡核苷酸引物进行延伸,并辅以Northern blotting、RT-qPCR等技术,确定RNA剪切加工的精确位点。【结果】鉴定了来自解纤维梭菌cip-cel mRNA中的2个剪切加工位点均位于颈环结构下游的单链区域,且在剪切位点附近未发现保守序列。【结论】基于Cy5.5标记的引物延伸法能够精确鉴定RNA剪切加工位点,且与传统的放射性引物延伸法相比,该方法具有更高的安全性和更快的检测速度,能够满足一般实验室的实验要求。     

人生殖道源乳酸杆菌的筛选及在小鼠阴道假丝酵母病模型中的应用评价

【目的】分离筛选人阴道环境中具有益生特性的乳酸杆菌,探索外阴阴道假丝酵母病的益生菌疗法。【方法】利用含1%碳酸钙的de Man,Rogosa and Sharpe (MRS)培养基从无症状育龄女性阴道分泌物中分离乳酸杆菌,采用共培养方法评价其对白色念珠菌(Candida albicans)的抑制作用,通过对乳酸杆菌的耐酸性能、体外聚集特性和黏附能力测试考察其益生特性,并进行乳酸杆菌株功能化组合。通过构建小鼠外阴阴道假丝酵母病模型,初步探索乳酸杆菌株组合对C. albicans的抑制作用。【结果】从53个样品中分离得到19株乳酸杆菌,筛选获得4株乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus ZH08、L. fermentum ZH09、L. fermentum ZH11和L. crispatus ZH17)具有较强抑制 C. albicans生长的能力。4株乳酸杆菌均能耐受低pH环境,能快速降低培养液pH。其中2株L. fermentum具有更强的抑制活性,能在24 h内快速抑制C. albicans生长,抑制率可达到95%以上;另2株L. crispatus具有更强的聚集特性和对上皮细胞有较强黏附性。乳酸杆菌ZH17和ZH11组合应用小鼠阴道假丝酵母病模型治疗,能显著抑制C. albicans生长和菌丝相转化,促进粘膜修复和缓解炎症。【结论】本研究筛选的乳酸杆菌具有生殖道益生菌的特性,乳酸杆菌组合应用具有潜在的临床前景。     

果实红色与黄色番茄品种植株茎部内生细菌群落结构及代谢功能特征

[目的]比较果实颜色分别为红色和黄色的番茄植株茎部内生细菌群落组成及代谢功能特征,旨在探究番茄果色形成与植株内生细菌的关联,为构建番茄育种新型的评价体系,以及开发利用有益微生物功能提供理论依据和技术支撑.[方法]基于MiSeq高通量测序技术,分析果实颜色分别为红色和黄色番茄品种植株茎部内生细菌群落组成及相关代谢功能生物...     

F-RNA噬菌体YM1肠道宿主分析

【背景】F-RNA噬菌体近年来常被作为水环境中诺如病毒污染的指示物。本课题组前期以大肠杆菌ATCC700891^T为宿主,从人便样中筛选出一株F-RNA噬菌体YM1,其与大肠杆菌噬菌体MS2亲缘关系最近,MS2宿主通常为含有性菌毛的雄性大肠杆菌。【目的】探索F-RNA噬菌体与其肠道宿主及诺如病毒之间的互作关系,筛选YM1的肠道宿主。【方法】采用选择性培养基筛选YM1阳性便样中的大肠杆菌并进行YM1侵染验证,结合16S rRNA基因扩增子测序分析YM1接种前后便样中的差异性菌群种类,对YM1阳性便样中潜在的YM1肠道宿主进行分析。【结果】筛选到351个大肠杆菌菌株,YM1侵染结果表明这些大肠杆菌均不是YM1的宿主;16S rRNA基因扩增子测序分析差异性菌种显示,Enterobacter sp. (OTU144)和Enterobacter sp. (OTU11)这2株肠杆菌属细菌的相对丰度在YM1感染后发生显著性的降低,表明该2种细菌可能为YM1的潜在肠道宿主。【结论】YM1具有严格的宿主特异性,便样中大肠杆菌并非YM1的肠道宿主,同时发现了2种YM1的潜在宿主,为进一步筛选分离YM1的肠道宿主提供了方向和依据。     

纳帕海高原湿地噬藻体g20基因系统发育多样性分析

【背景】噬藻体是感染蓝藻的病毒,是水生系统的重要组成部分。它们对宿主种群死亡率有重要影响,是控制蓝藻水华生消的潜在因子,对蓝藻群落结构的调控具有重要意义。大量研究揭示了海洋和淡水环境中噬藻体的高度多样性,但目前对高原湿地中噬藻体的多样性知之甚少。【目的】阐明我国纳帕海高原湿地噬藻体g20基因的遗传多样性,为进一步开展高原湿地微生物资源及其生态功能研究提供理论基础。【方法】采集雨季的水体样品,以衣壳蛋白基因g20为标记基因,利用特异性引物Cps1和Cps8对其进行PCR扩增,得到26条不同的g20基因有效序列,并将其与其他生境中g20基因序列进行主坐标分析和系统发育分析。【结果】与其他海洋和淡水的噬藻体序列相比,纳帕海高原湿地中噬藻体的序列与其他稻田序列更为相近;但也存在部分序列单独聚簇,这可能为纳帕海高原湿地中独有的噬藻体类型。【结论】表明该地区的噬藻体较丰富,并具有一定的独特性。     

短乳杆菌与植物乳杆菌的发酵特性

【背景】目前对于酸菜发酵的研究主要关注点是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),有关短乳杆菌(Lactobacillus brevis)在酸菜方面的研究报道很少。【目的】为了挖掘短乳杆菌的发酵性能并开发酸菜发酵剂,将2株短乳杆菌分别与1株植物乳杆菌进行组合并发酵酸菜,分析短乳杆菌对酸菜发酵品质的影响。【方法】分别测定短乳杆菌与植物乳杆菌的单菌株生长产酸性能、耐酸性及亚硝酸盐降解力,并将两菌种组合后发酵酸菜,分析1-7d内酸度、乳酸菌活菌数、亚硝酸盐含量及酸菜质构特性的变化趋势。【结果】相较于短乳杆菌Lb-9-2,短乳杆菌Lb-5-3的生长和产酸速率较慢、酸耐受力较弱,但其亚硝酸盐降解力较强。两株短乳杆菌分别与植物乳杆菌Lp-9-1组合后产酸力显著增强,并在3 d时达到最低pH值(约3.10);植物乳杆菌Lp-9-1的添加使酸菜中总体乳酸菌生长延迟,在5 d时达到最高活菌数;组合菌种的样品中亚硝酸盐含量在1-7 d内变化较为平缓,前5天内两个组合之间差异不显著;接种乳酸菌会降低酸菜硬度和弹性,发酵3d时Lb-5-3/Lp-9-1组合的硬度最大,感官评价得分最高。【...