表达LacZ基因的重组CVI988病毒的构建及特性研究

马立克氏病(MD)是一种鸡的淋巴增生性肿瘤疾病,是由马立克氏病病毒血清1型(Marek'sdisease virus serotype 1,MDV1)引起的,但是,可以由致弱的或天然不致病的疫苗株进行防制.疫苗株分为三种类型:致弱的血清1型,天然不致瘤的血清2型(MDV2)和天然不致病的火鸡疱疹病毒(HVT).     

接种不同毒力的马立克氏病病毒后鸡病毒血症的动态比较

1日龄非免疫鸡分别接种马立克氏病病毒（MDV）I型强毒GA株、I型MDV疫苗毒CVI988株和III型火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗株后第4日起,定期采血并用抗MDV囊膜糖蛋白B（gB）单克隆抗体介导的间接免疫荧光试验检测MDV在外周血液单核细胞（PBMC     

马立克氏病血清Ⅰ型致瘤株病毒感染的早期检测

马立克氏病（MD）是养禽业最重要的疫病之一,一直缺少有效的早期诊断方法。根据血清Ⅰ型马立克氏病毒（MDVⅠ）meq基因的核酸序列设计了一对寡苷酸核引物,分别对MDVR1致瘤株（京－1株）、非致瘤株（MD11／75C株、CV1988株）、MDV2（SB－1株）、HVT（Fv-126株）的核酸进行扩增。结果表明：京－1株扩增到约1.15kb核酸片段,MD11／75C株和CVI988株的扩增产物都与Digoxigenin标记的meq基因探针杂交,说明都是特异性的扩增产物,对MSB1细胞DNA及MDV感染鸡的血液及肝、肾肿瘤等DNA扩增都得到1.15kb条带,将京－1株和CV1988株感染的细胞DNA混合再扩增,同时得到1.15kb和1.0kb的核酸条带,所以根据拉增产物大小可以区别致瘤株京－1株及非致瘤株CV1988株,这表示可从CV1988株病毒免疫鸡体内检测到MDV强毒,适于早期确诊强毒感染。     

鸡马立克氏病毒Ⅱ型无毒株Z_4的分离和鉴定

从扬州市郊区土种鸡中分离到一株血清Ⅱ型马立克氏病毒(MDV)Z4株,并进行了鉴定。初次分离时,Z4在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长缓慢,12天后产生以圆形大合胞体为特征的空斑形态。用Z4CEF培养物接种易感鸡,13周内不引起任何马立克氏病临床症状,也无大体的病理变化,显微镜检查仅部分鸡的坐骨神经出现炎性细胞浸润。保护性实验证明,接种Z4株的鸡可抵抗MDV强毒的致瘤作用,表明它是很有希望的疫苗候选毒株。 用型特异性单克隆抗体,对MDV强毒株京-1株、弱毒株K株,以及作者新分离的另外9个分离物进行了血清型鉴定。证实京-1株、K株和5个分离物为Ⅰ型病毒;2个为Ⅱ型病毒;另有2个分离物同时含有Ⅰ型和Ⅲ型病毒。本工作为进一步研究不同血清型MDV在我国鸡群中的流行和分布规律打下了基础。     

Ⅰ型马立克氏病病毒不同致病型参考株与中国分离株pp24基因的克隆与序列分析

为了比较Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)的致病型与pp24基因的关系,将Ⅰ型MDV弱毒(mMDV)、强毒(vMDV)、超强毒(vvMDV)、特超强毒(vv MDV)等不同致病型的CVI988、GA、648A、RB1B、Md5和Md11等6个国际参考株,从中国河北、北京、广东和广西等地分离的7个中国分离株和1个中国疫苗毒814株的pp24基因分别做PCR扩增,并将其克隆到pMD-18载体中测序,与国外已发表的BC-1株进行序列比较.结果表明:Ⅰ型MDV的pp24基因非常保守,15个毒株中只出现5个碱基的随机变化,并引起相应的4个氨基酸改变,但与致病型无明显相关;pp24基因ORF的第81碱基出现差异,所有中国株为G,所有不同致病型国外参考株为C,但并未引起氨基酸改变,显示这一碱基差异只是作为MDV地域性分布的遗传标志,而与病毒分离的年代及致病型等因素无关.     

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CV1988／Ripens株、强毒株GA、超剜毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株Jing-1及3个中国野毒株。结果表明：MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96．7％～100％之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99．2％～100％之间。尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系。     

接种不同毒力的马立克氏病病毒后鸡病毒血症的动态比较

1日龄非免疫鸡分别接 马立克氏病病毒（MDV）Ⅰ强毒GA株、Ⅰ型MDV疫苗毒CVI988株和Ⅲ型火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗株后第4日起,定期采血并和抗MDV囊膜糖蛋白B(gB)单克隆抗体介导的间接免疫荧光试验检测MDV在外周因液单核细胞（PBMCs）中的感染状况。结果发现,自接种Ⅰ型强毒GA株后第4日至鸡发病死亡前,都能检出GA株引起的病毒血症,并于2周左右达到高峰;自接种CVI988株后第4日至第20日止,能检出病毒血症,并于第8天左右达到高峰;自接种HVT后第4日至第16日止,能检出病毒血症,并于第6天左右达到高峰。与此同时,将GA株病毒血症的IFA检测结果与细胞培养上病毒空班计数试验结果比较,发现IFA试验比空斑计数试验更为敏感。本试验既可用于判断对鸡作MDV疫苗免疫的接种效果,又可用于检测MDV野毒感染状态。     

带有REV-LTR片段的马立克氏病毒重组野毒株与超强毒株致病性和传播性比较

摘要：【目的】GX0101是一株插入了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)-LTR片段的马立克氏病毒（MDV）重组野毒株,本文将其致病性、致肿瘤性和横向传播能力与超强毒参考株（vvMd5）进行比较。【方法】利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA进行检测。【结果】在经抗MDV疫苗免疫的SPF鸡攻毒试验中表明,GX0101株的致死率28.6%和致肿瘤率7.1%均低于超强毒参考株Md5的致死率63.1%和致肿瘤率19.0%。但是,利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA检测表明,     

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CVI988/Ripens株、强毒株GA、超强毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株.Jing-1及3个中国野毒株.结果表明MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96.7%～100%之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99.2%～100%之间.尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系.     

串联表达马立克氏病病毒糖蛋白B主要抗原决定簇基因的重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性疾病,病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤发生单核细胞浸润为特征[1].MD是世界上最重要的家禽传染病之一,是造成世界养禽业重大经济损失的一个主要原因.20世纪70年代早期MD疫苗的发现才使MD得到控制[2].     

表达GFP基因的马立克氏病病毒(MDV)转移载体的构建及初步应用

利用Primer primer 5.0软件设计两条引物,将loxP位点分别引入正、反向引物,以质粒载体pIRES-gpt为模板,扩增获得LoxP-CMV-gpt-IRES-LoxP基因表达盒(约2.9kb),将其克隆入质粒pBUS10 (含有MDV US10区) 的BalⅠ位点,获得重组质粒 pUS-gptIRES(L);对重组质粒pUS-gptIRES(L)进行测序分析,发现两同向的loxP位点正确插入到pUS-gptIRES(L)中;将含有完整的GFP基因以及poly A尾的基因片断,连入pUS-gptIRES(L)中,把gpt基因替换掉,从而获得重组质粒pUS-GFPIRES(L)。将转移载体pUS-GFPIRES(L)瞬时转染CHO细胞,可以观察到绿色荧光,说明GFP基因获得有效表达;将pUS-GFPIRES(L) 转染已感染MDV CVI988株的CEF细胞,可以筛选到表达绿色荧光蛋白的重组病毒;通过测定重组病毒在细胞上的生长曲线,发现重组病毒与亲本毒生长曲线相吻合。本研究为进一步探讨MDV在体内的特性奠定基础,同时,为Cre/LoxP重组酶系统在MDV中的应用奠定基础。     

由反转录病毒载体转移的马立克病毒糖蛋白D基因在感染细胞中的表达

用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ将已分离和克隆的马立克氏病病毒糖蛋白Ｄ基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出,克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载全ＰＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用ＣｌａＩ再次ｇＤ基因切出,构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ,并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）,转染后第９天收集细胞上     

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

提取马立克氏病毒Ⅰ型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T—easy载体。将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP。用脂质体将其与CVI988株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况。表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒。     

利用细菌人工染色体技术构建整合F基因的重组MDV疫苗株*

目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。     

马立克氏病病毒Rispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

马立克氏病病毒（Ｍａｒｅｋ’ｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ,ＭＤＶ）是马立克氏病（ＭＤ）的病原,是第一个能用实验证明具有致肿瘤作用的疱疹病毒,也是研究病毒性肿瘤特别是疱疹病毒肿瘤的理想的实验模型。ＭＤ还是第一个广泛使用疫苗预防的肿瘤性病毒病。应用免疫扩散...     

马立克氏病病毒REispens株B抗原基因的克隆及其重组鸡痘病毒的构建

Purified DNAs from Chicken Embryo Fibroblast (CEF) cultures infected with MDV strain Rispens were used as templates. Specific fragment with the size of about 2.9 kb was successfully amplified through Polymerase Chain Reaction(PCR) and identified to be gB gene of MDV by dot blot hybridization with a digoxigenin-labelled MDV gB specific oligonucleotide probe. The gB gene from strain Rispens was cloned into pUC19 and FPV insertion vector pFG1175-1 to construct plasmid pMGB and pFGBR1775-1 respectively. DOSPER liposome-mediated transfection with insertion vector DNA pFGBR1175-1 was performed on CEF monolayers infected with FPV 3-4 h earlier. Recombinant FPV was clone purified. Immunofluorescence Assay(IFA) showed that MDV gB gene had been expressed in FPV.     

Isolation of recombinant field strains of Marek’s disease virus integrated with reticuloendotheliosis virus genome fragments

Two Marek's disease virus (MDV) field strains were isolated from chickens with tumors independently from Guangdong and Guangxi provinces, and it was confirmed that there were no co-infections with reticuloendotheliosis viruses (REV) in chicken embryo fibroblast cells (CEF) in indirect fluorescence antibody test (IFA) with REV-specific monoclonal antibodies. By dot blot hybridization and PCR of genomic DNA of MDV-infected CEF, it was indicated that LTR fragments of REV genome were integrated into genome of these two MDV field strains. To amplify and clone the integrated REV LTR with MDV sequence at the junction, 4 primers from REV LTR and 7 primers from MDV genome fragment with REV LTR insertion hot points were synthesized and 28 (4x7) pairs of primers (one from REV and another from MDV for each pair) were used in PCR while using the genomic DNA of both strains as the templates. The sequence data demonstrated that both recombinant field strains contained the same REV LTR inserted into MDV at the identical sites in US fragment of the genomes. From the above, it was speculated that both recombinant field MDVs were originated from a same recombinant virus and spread among chicken flocks in two provinces.     

Isolation of recombinant field strains of Marek's disease virus integrated with reticuloendotheliosis virus genome fragments

Two Marek's disease virus (MDV) field strains were isolated from chickens with tumors independently from Guangdong and Guangxi provinces, and it was confirmed that there were no co-infections with reticuloendotheliosis viruses (REV) in chicken embryo fibroblast cells (CEF) in indirect fluorescence antibody test (IFA) with REV-specific monoclonal antibodies. By dot blot hybridization and PCR of genomic DNA of MDV-infected CEF, it was indicated that LTR fragments of REV genome were integrated into genome of these two MDV field strains. To amplify and clone the integrated REV LTR with MDV sequence at the junction, 4 primers from REV LTR and 7 primers from MDV genome fragment with REV LTR insertion hot points were synthesized and 28 (4x7) pairs of primers (one from REV and another from MDV for each pair) were used in PCR while using the genomic DNA of both strains as the templates. The sequence data demonstrated that both recombinant field strains contained the same REV LTR inserted into MDV at the identical sites in US fragment of the genomes. From the above, it was speculated that both recombinant field MDVs were originated from a same recombinant virus and spread among chicken flocks in two provinces.