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目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。 相似文献
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采用草鱼呼肠孤病毒腹腔注射草鱼,通过定量RT-PCR检测了12个抗病毒免疫相关基因在鳃中不同时间点的表达模式,以了解鳃对内源性病毒的免疫应答。模式识别受体基因CiTLR3、CiTLR7、CiTLR22、CiRIG-I、CiMDA5、CiLGP2、CiNOD1和CiNOD2,以及干扰素基因CiIFN-I的表达在注射病毒后12h、24h、48h及72h基本都上调。IgM基因的表达仅在72h上调。接头分子CiMyD88和CiIPS-1基因的表达在早期下调(6h),然后逐渐上升。为了证实病毒感染的可靠性,通过RT-PCR检测了病毒VP4基因。结果表明草鱼鳃在抗病毒免疫方面发挥着重要作用。 相似文献
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本研究旨在利用水稻胚乳生物反应器表达新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) HN蛋白,建立一种NDV抗体半定量、快速免疫层析检测方法。通过MlyⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pUC57-HN,NaeⅠ和XhoⅠ双酶切包含有启动子、信号肽和终止子的pMP3中间载体,分别回收HN和pMP3片段并进行连接,构成重组质粒pMP3-HN1。然后利用Eco RⅠ和HindⅢ双酶切pMP3-HN1和植物载体pCAMBIA1300,将HN1基因成功连接到pCAMBIA1300上,采用电转化方法将重组质粒pCAMBIA1300-HN1导入根癌农杆菌EHA105。通过农杆菌介导法将pCAMBIA1300-HN1转入水稻愈伤组织。经过暗培养、愈伤筛选、分化、生根和移栽,4个月后获得转基因水稻种子。经PCR鉴定,HN基因已插入到水稻基因组中。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果表明,水稻胚乳成功表达了HN蛋白,且该蛋白通过SP阳离子层析和凝胶过滤层析,其纯度达到90%以上。根据国家制定的新城疫血凝抑制(hemagglutination inhibition, HI)试验诊断技术标准(HI≥4log2,检测的抗体为阳性),利用胶体金标记HN蛋白,通过双抗夹心法制备NDV抗体半定量快速检测试纸。结果显示:试纸与其他病毒的阳性血清无交叉反应,且试纸对新城疫标准阳性血清的敏感性可达到1︰102 400。根据308份临床血清的检测结果,NDV抗体试纸与和HI试验的符合率为97.08%,Kappa值为0.942。综上所述,获得了高纯度水稻胚乳表达的重组HN蛋白,并研制了一种简单、快速、灵敏度高、特异性强的半定量免疫层析试纸。该试纸能够初步应用于新城疫疫苗的免疫评价。 相似文献
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