不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CVI988/Ripens株、强毒株GA、超强毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株.Jing-1及3个中国野毒株.结果表明MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96.7%～100%之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99.2%～100%之间.尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系.     

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CV1988／Ripens株、强毒株GA、超剜毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株Jing-1及3个中国野毒株。结果表明：MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96．7％～100％之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99．2％～100％之间。尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系。     

Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达

本研究将Ⅰ型超强毒MDV Md11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达.然后将MDV Md11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行Western-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达.     

特超强毒型马立克病病毒囊膜糖蛋白I基因序列及与其它致病型毒株的比较

特超强毒型648A株马立克病病毒(MDV)的囊膜糖蛋白I(gI)基因经PCR扩增后克隆进pUC18质粒载体,并对其ORF完成了DNA测序.与已发表的其它致病型毒株的糖蛋白I的DNA和氨基酸序列比较表明,648A株的gI基因序列与超强毒RBIB株已发表的ORF 5'端761个碱基完全相同.但是在该基因中完整ORF的1068个碱基中,648A株与强毒GA株间有8个碱基变异并导致7个氨基酸的变化,且这一变化主要发生在该基因的5'端,其3'端三分之一完全相同.     

特超强毒型马立克病病毒囊膜糖蛋白I基因序列及与其它致病型毒株的比较

特超强毒型 6 48A株马立克病病毒 (MDV)的囊膜糖蛋白I(gI)基因经PCR扩增后克隆进pUC18质粒载体 ,并对其ORF完成了DNA测序。与已发表的其它致病型毒株的糖蛋白I的DNA和氨基酸序列比较表明 ,6 48A株的 gI基因序列与超强毒RBIB株已发表的ORF 5′端 76 1个碱基完全相同。但是在该基因中完整ORF的 10 6 8个碱基中 ,6 48A株与强毒GA株间有 8个碱基变异并导致 7个氨基酸的变化 ,且这一变化主要发生在该基因的 5′端 ,其 3′端三分之一完全相同     

特超强毒型马立克病病毒囊膜糖蛋白Ⅰ基因序列及与其它致病型毒 …

特超强毒型６４８Ａ株马立克病病毒（ＭＤＶ）的囊膜糖蛋白Ｉ（ｇＩ）基因经ＰＣＲ扩增后克 进ｐＵＣ１８质粒载体,并对其ＯＲＦ完成了ＤＮＡ测序。与已发表的其它室致病型毒株的糖蛋白Ｉ的ＤＮＡ和氨基酸序列比较表明,６４８Ａ株的ｇＩ基因序列与超强毒ＲＢＩＢ株已发表的ＯＲＦ５’端７６１个碱基完全相同。查是在该基因中完整ＯＲＦ的１０６８个碱基中,６４８Ａ与强毒ＧＡ株间有８个碱基变异并导致７个氨基酸的变化,且这一变     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定

近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)属于甲亚科疱疹病毒,血清I型MDV(MDV-1)感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病(Marek’s disease,MD)肿瘤发生中具有重要作用。本文以超强毒MDV(very virulent MDV,vvMDV)国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序。结果证实,meq基因被完全编辑并敲除。间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定。通过荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)对病毒增殖曲线进行测定,证实meq基因编辑不影响病毒的体外复制。本研究建立了CRISPR/Cas9系统快速编辑MDV-1病毒基因的技术方法,获得了稳定的meq基因缺失毒株,为后续MDV-1的致病及致瘤机制研究、MEQ单抗筛选鉴定及诊断试剂研发等奠定了重要基础。     

马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达

通过PCR方法扩增MDV Md11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达.诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达.将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清.所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性.     

特超强毒648株马立克氏病病毒的囊膜糖蛋白gE基因的克隆和序列比较

鸡马立克氏病毒特超强毒 (vv+MDV) 648株的囊膜糖蛋白 gE基因经PCR扩增并克隆入pUC1 8载体。 648株gE基因经核酸序列分析测定 ,全长为 1 494碱基。所编码的蛋白具有跨膜糖蛋白的一些特征。它含有 8个潜在的糖基化位点、N端有一段疏水区 (1～ 1 9aa)所构成的信号肽、C端有一段疏水区 (391～ 41 9aa)所构成的膜锚着序列。经 648株 (vv+MDV)和马立克氏病毒强毒 (vMDV)GA株的 gE相比较 ,在MDV血清 1型中 gE是较为保守的 ,二者仅有 2个核苷酸的差异 (第 51 2位、第 1 472位 ) ,并导致了有二个相应的氨基酸的改变 (第1 71位Leu/Pro、第 491位Arg/Lys)。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定

近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒。马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）属于甲亚科疱疹病毒,血清Ⅰ型MDV（MDV-1）感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤。meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病（Marek’s disease,MD）肿瘤发生中具有重要作用。本文以超强毒MDV（very virulent MDV,vvMDV）国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序。结果证实,meq基因被完全编辑并敲除。间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定。通过荧光定量PCR（quantitative PCR,qPCR）对病毒增殖曲线进行测定,证实meq基因编辑不影响病毒的体外复制。本研究建立了CRISPR/Cas9系统快速编辑MDV-1病毒基因的技术方法,获得了稳定的meq基因缺失毒株,为后续MDV-1的致病及致瘤机制研究、MEQ单抗筛选鉴定及诊断试剂研发等奠定了重要基础。     

马立克氏病毒meq基因缺失株SC9-1通过自然重组获得meq能力的分析

为了探究meq基因缺失的马立克氏病毒疫苗株SC9-1与超强毒株Md5是否能够通过自然重组获得meq基因的能力,将SC9-1疫苗毒和Md5超强毒共同感染鸡胚成纤维细胞(CEF),并在CEF上连续传三代,提取单个蚀斑的病毒DNA。同时将Md5超强毒接种免疫过SC9-1疫苗株的SPF鸡,在不同的时间点分离病毒,提取单个蚀斑的病毒DNA。将两种方式获得的病毒DNA进行PCR验证,并将香啤酒重组酶位点(FRT)残留序列克隆测序,比较其同源性。两种方式鉴定的病毒均为SC9-1或是Md5,没有检测到重组病毒,而且FRT残留序列同源性为100%。结果 SC9-1没有从野生毒株Md5获得缺失的meq基因,而且meq基因敲除区具有很好的遗传稳定性。     

I型马立克氏病毒38kD磷蛋白与Ⅱ和Ⅲ型病毒间的交叉免疫反应

由致病性Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)特异性的单克隆抗体H_(19)制备亲和层析柱,从感染重组杆状病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞系Sf9细胞中提纯MDV的pp38基因表达产物,以此免疫小鼠制备抗血清,测定其与不同型MDV毒株感染的鸡胚成纤维细胞免疫反应性,同时也用不同型MDV毒株(HVT,Z4)制备的抗血清和自然感染发病鸡血清分别与感染重组病毒的Sf9细胞进行免疫交叉反应.试验结果表明,完整的Ⅰ型MDV来源的pp38基因产物与所试Ⅱ型Z4株和Ⅲ型HVT Fc126毒株在抗原性上有显著交叉反应.这一结果表明,在Ⅱ型和Ⅲ型MDV毒株中可能存在着pp38的类似物.     

马立克氏病毒meq基因缺失株SC9-1通过自然重组获得meq能力的分析北大核心CSCD

为了探究meq基因缺失的马立克氏病毒疫苗株SC9-1与超强毒株Md5是否能够通过自然重组获得meq基因的能力,将SC9-1疫苗毒和Md5超强毒共同感染鸡胚成纤维细胞(CEF),并在CEF上连续传三代,提取单个蚀斑的病毒DNA。同时将Md5超强毒接种免疫过SC9-1疫苗株的SPF鸡,在不同的时间点分离病毒,提取单个蚀斑的病毒DNA。将两种方式获得的病毒DNA进行PCR验证,并将香啤酒重组酶位点(FRT)残留序列克隆测序,比较其同源性。两种方式鉴定的病毒均为SC9-1或是Md5,没有检测到重组病毒,而且FRT残留序列同源性为100%。结果 SC9-1没有从野生毒株Md5获得缺失的meq基因,而且meq基因敲除区具有很好的遗传稳定性。     

马立克氏病病毒38 kd磷蛋白H19-和T65-抗原表位分析及鸡对该抗原表位点突变病毒的免疫反应

对马立克氏病病毒(MDV)38 kd 磷蛋白(pp38)基因的编码序列的测定表明, 所有在间接荧光抗体试验(IFA)中与单抗H19反应的10个不同致病型MDV毒株, 在第320位碱基为“A”, 相应第107位氨基酸是谷氨酰胺, 而在IFA中不与单抗H19反应的疫苗株CVI988相应位点分别是“G”和精氨酸. 另一方面, 在IFA中能与另一个单抗T65反应的毒株, 在第326位碱基是“G”, 第109位氨基酸是甘氨酸, 而其他不与单抗T65反应的毒株, 相应位点碱基和氨基酸分别是“A”和谷氨酸. 通过比较CVI988及其在pp38基因的第320和326位的单一或双碱基点突变病毒CVI988/rpp38(AG)和CVI/rpp38(AA)对H19和T65的反应性, 证明了在第107和109位的谷氨酰胺和甘氨酸分别对pp38上的H19和T65两个抗原表位起关键作用. 比较CVI988及其点突变株CVI/rpp38(AG)在SPF鸡诱发的抗体反应表明, 接种了点突变株CVI/rpp38(AG)鸡的抗体反应出现得比天然株抗体反应明显延缓且显著降低. 进一步对MDV不同抗原成分的相应抗体水平比较表明, 该功能区内可能存在着第3个特异性抗原表位, 它决定于CVI988株pp38第107位的精氨酸, 而且天然CVI988株及其点突变株诱发的抗MDV抗体水平间的显著差异可能正与这个抗原表位相关.     

禽Ⅰ型副粘病毒各种禽源分离株毒力及其相关基因的研究

用测定新城疫病毒(NDV)毒力的经典方法,即鸡胚平均死亡时间(MDT)和脑内接种致病指数(ICPI),对源于鸡、鸽、鹅、珍珠鸡、孔雀、鹌鹑和画眉鸟等7种禽(鸟)源的共14个禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)广西分离株,分别测定了毒力。同时对分离株F基因的N一端前段和HN基因的e末端片段进行扩增、测序和分析,并绘制系谱树。结果发现,分离株的MDT在36h～75h之间,除1株鸽源毒株gxp22的ICPI值为0外,其余分离株在1．09～1．95之间;除孔雀源的分离株gxpc52在F基因裂解位点附近的氨基酸序列为^112R-RQ-R-R-F^117之外,其它13株均为^112R-R-Q-K-R-F^117,都符合强毒株的特征。所有分离株与国内参考强毒株F48E8和国外参考强毒株HER／33在HN基因e末端终止密码子的位置相同,也符合强毒株的特征。根据F基因核苷酸序列绘制的系谱树发现,近几年来在广西流行的APMV-1毒株的基因型为Ⅶd亚型;根据HN基因核苷酸序列绘制的系谱树表明,广西各种禽源APMV-1分离株可分为2个群。研究的结果表明,根据F基因裂解位点附近的氨基酸序列和HN蛋白翻译的终止密码子的位置判定APMV-1毒力的结果,都与毒株在临床上的致病情况相符。因此,根据F基因和HN基因序列和结构的特征,均可以判定APMV-1临床分离株的体内致病性。     

鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析

为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株DHAV-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株DHAV-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.9%和95.0%～100%。与GenBank中公布的31株DHAV-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100%和90.8%～100%。系统进化分析显示,DHAV-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征。     

4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析

根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析.序列比较显示,不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守,它们相互间氨基酸序列的同源性在96.5%～99.7%之间.4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变;3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变,这两处点突变是国内近几年分离株所特有的,国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化.分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性,但是这些规律性还有待进一步研究.     

Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达

本研究将Ⅰ型超强毒MDVMd11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达。然后将MDVMd11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行West-ern-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达。     

马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达

通过PCR方法扩增MDVMd11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达。诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达。将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清。所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFAA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性。     

带有REV-LTR片段的马立克氏病毒重组野毒株与超强毒株致病性和传播性比较

摘要：【目的】GX0101是一株插入了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)-LTR片段的马立克氏病毒（MDV）重组野毒株,本文将其致病性、致肿瘤性和横向传播能力与超强毒参考株（vvMd5）进行比较。【方法】利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA进行检测。【结果】在经抗MDV疫苗免疫的SPF鸡攻毒试验中表明,GX0101株的致死率28.6%和致肿瘤率7.1%均低于超强毒参考株Md5的致死率63.1%和致肿瘤率19.0%。但是,利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA检测表明,