柔嫩艾美耳球虫基因在丝状体蓝藻中的克隆

以纯化的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵巢为模板,根据已知的序列设计一对引物,用RT－PCR方法扩增出球虫的S07基因,通过三亲接合转移、新霉素筛选、序列分析等方法得到了转球虫基因工程蓝藻。这为球虫基因在蓝藻中表达奠定了基础。     

通过同源重组在聚球藻7002中表达小鼠金属硫蛋白-Ⅰ的初步研究

用PCR方法从海洋单细胞蓝藻聚球藻7002(Synechococcus sp. PCC 7002)基因组DNA中扩增得到藻蓝蛋白β亚基基因(cpcβ)的上游序列(Pcpcβ),及编码谷氨酰胺合成酶的glnA基因片段.以Pcpcβ作为启动子、以glnA基因片段作为整合平台,构建含有小鼠金属硫蛋白-Ⅰ(mMT-Ⅰ)cDNA的同源整合表达载体pKGC-MT.通过自然转化法将整合表达载体导入聚球藻7002中,经氨苄青霉素筛选,得到遗传性状稳定的转基因藻.PCR检测证明mMT-Ⅰ基因已整合到蓝藻基因组DNA上;蛋白质印迹表明mMT-Ⅰ已在蓝藻中表达;ELISA结果显示mMT-Ⅰ在蓝藻中的表达量约为800 μg/g.     

蓝藻基因转移系统的选择与建立

蓝藻是一类进行光合放氧的原核生物 ,因其结构的特殊性 ,已成为表达外源基因的理想宿主之一。然而外源基因转化系统的选择与建立一直影响着蓝藻基因工程的快速发展。总结了各类蓝藻基因转移系统的特点、影响因素、各系统间的优缺点、以及不同蓝藻株系最适基因转移系统的选择等 ,为利用蓝藻进行遗传操作提供可能 ,为蓝藻基因工程发展提供信息。     

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示:从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。     

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交（SSH）技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示：从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。     

通过同源重组在聚球藻7002中表达小鼠金属硫蛋白-Ⅰ的初步研究

用PCR方法从海洋单细胞蓝藻聚球藻7002（Synecohococcus sp.PCC7002)基因组DNA中扩增得到藻蓝蛋白β亚基基因（cpcβ)的上游序列（Pcpcβ),及编码谷氨酰胺合成酶的glnA基因片段,以Pcpcβ作为启动子,以glnA基因片段作为整合平台,构建含有小鼠金属硫蛋白-Ⅰ（mMT-Ⅰ)cDNA的同源整合表达载体pKGC-MT,通过自然转化法将整合表达载体导入聚球藻7002中,经氨苄青霉素筛选,得到遗传性状稳定的转基因藻,PCR检测证明mTM-Ⅰ基因已整合到蓝藻基因组DNA上;蛋白质印迹表明mMT-Ⅰ已在蓝藻中表达;ELISA结果显示mMT-Ⅰ在蓝藻中的表达量约为800μg/g。     

蓝藻Oscillatoriaceae rDNA16S-23S基因间隔区的序列分析及其分类学意义

采用末端终止法对蓝藻类颤藻科Oscillatoria sp.rDNA 16S-23S基因间隔区进行了序列测定,获得了Oscillatoria sp.rDNA基因间隔区427个核苷酸,其中包含1个异亮氨酸tRNA基因(tRNAIle).并通过计算机联网从国际分子生物学数据弹库中获取颤藻科其它种的rDNA 基因间隔区序列,通过比较分析,从分子水平对颤藻科Oscillatoriaceae属间的某些分类学问题进行了讨论,并根据序列中核苷酸差异值探讨了颤藻科属间界定的分子标准.提出了rDNA 基因间隔区是良好的分子标记,可用于"赤潮"或"水华"蓝藻专一性核酸分子探针的研制.     

东北虎源等孢球虫的发现

对东北虎粪便进行虫卵检查,分离获得了自然感染的球虫卵囊。对球虫卵囊的形态和经培养发育后的各阶段的卵囊形态进行了观察。东北虎源球虫卵囊符合等孢属球虫的形态学特征。根据Genbank 上发表的猫等孢球虫18S rDNA 序列(L74671)设计一对特异性引物,利用PCR 技术对东北虎源球虫的18S rDNA 进行了扩增。扩增得到一段360 bp 的DNA 片段,并对该片段进行了序列测定。测序结果和其它17 种原虫的相应序列进行序列同源性比较分析,分析显示东北虎源球虫和其它等孢属球虫单独聚为一类。结合对东北虎源球虫的卵囊形态、卵囊发育情况及序列分析结果,确定其为等孢属球虫。      

蓝藻OscilatoriaceaerDNA16S-23S基因间隔区的序列分析及其分类学意义

采用末端终止法对蓝藻类颤藻科Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｓｐ．ｒＤＮＡ１６Ｓ－２３Ｓ基因间隔区进行了序列测定,获得了Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｓｐ．ｒＤＮＡ基因间隔区４２７个核苷酸,其中包含１个异亮氨酸ｔＲＮＡ基因（ｔＲＮＡＩｌｅ）。并通过计算机联网从国际分子生物学数据弹库中获取颤藻科其它种的ｒＤＮＡ基因间隔区序列,通过比较分析,从分子水平对颤藻科Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｃｅａｅ属间的某些分类学问题进行了讨论,并根据序列中核苷酸差异值探讨了颤藻科属间界定的分子标准。提出了ｒＤＮＡ基因间隔区是良好的分子标记,可用于“赤潮”或“水华”蓝藻专一性核酸分子探针的研制     

鸡球虫18S rRNA基因序列的测定与分析

为了利用18S rRNA基因进行鸡球虫系统进化分析,对巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)、柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、堆形艾美耳球虫(E.acervulina)3种共8个不同来源的虫株,分别提取总DNA进行18S rRNA基因的扩增和测序;将得到的序列登录GenBank进行同源性和趋异性分析,并结合GenBank中其它原虫的18S rRNA基因序列构建进化树.结果显示扩增获得8株鸡球虫18S rRNA基因长度为1746～1756 bp,序列比对显示同种不同株间的同源性大于不同种间的同源性,其中3株E.maxima株间同源性在98.7%～99.3%之间,4株E.tenella株间同源性在99.7%～99.9%之间;不同种间同源性为96.5%～98.1%,其中E.maxima与E.tenclla的遗传距离最大,为0.038;E.maxima与E.acervulina的遗传距离最小,为0.021.顶复器门9个不同属所构建的进化树结果显示,E.imeria和等孢属(Isospora)聚为一支,说明亲缘关系比较近.与GertBank中其它5株不同鸡球虫的18S rRNA基因共同构建的进化树显示,3株E.maxima聚为一支,与E.brunetti、E.mitis、E.mivati、E.praecox和E.acervulina聚为一大分支;4株E.tenella与1株E.necatrix共同形成一个分支,说明E.tenella与E.necattix的亲缘关系最近.本研究证实了在鸡球虫系统进化研究中,18S rRNA基因不仅可以区分不同种,而且有可能成为区分同种不同株的理想靶基因.     

层理鞭枝藻藻蓝蛋白E和F基因的克隆及序列分析

克隆并测定了层理鞭枝藻藻蓝蛋白E和F基因全序列,通过将其氨基酸序列与其他蓝藻的相应序列进行比较,表明层理鞭枝藻中cpcE,cpcF所编码的蛋白质是层理鞭枝藻中α-CPC生命合成的连接酶。     

纳帕海高原湿地噬藻体g20基因系统发育多样性分析

【背景】噬藻体是感染蓝藻的病毒,是水生系统的重要组成部分。它们对宿主种群死亡率有重要影响,是控制蓝藻水华生消的潜在因子,对蓝藻群落结构的调控具有重要意义。大量研究揭示了海洋和淡水环境中噬藻体的高度多样性,但目前对高原湿地中噬藻体的多样性知之甚少。【目的】阐明我国纳帕海高原湿地噬藻体g20基因的遗传多样性,为进一步开展高原湿地微生物资源及其生态功能研究提供理论基础。【方法】采集雨季的水体样品,以衣壳蛋白基因g20为标记基因,利用特异性引物Cps1和Cps8对其进行PCR扩增,得到26条不同的g20基因有效序列,并将其与其他生境中g20基因序列进行主坐标分析和系统发育分析。【结果】与其他海洋和淡水的噬藻体序列相比,纳帕海高原湿地中噬藻体的序列与其他稻田序列更为相近;但也存在部分序列单独聚簇,这可能为纳帕海高原湿地中独有的噬藻体类型。【结论】表明该地区的噬藻体较丰富,并具有一定的独特性。     

通过同源重组在聚球藻7002中表达小鼠金属硫蛋白-Ⅰ的初步研究

用PCR方法从海洋单细胞蓝藻聚球藻7002（Synechococcus sp. PCC 7002）基因组DNA中扩增得到藻蓝蛋白β亚基基因（cpcβ）的上游序列（Pcpcβ）,及编码谷氨酰胺合成酶的glnA基因片段．以Pcpcβ作为启动子、以glnA基因片段作为整合平台,构建含有小鼠金属硫蛋白-Ⅰ（mMT-Ⅰ）cDNA的同源整合表达载体pKGC-MT.通过自然转化法将整合表达载体导入聚球藻7002中,经氨苄青霉素筛选,得到遗传性状稳定的转基因藻.PCR检测证明mMT-Ⅰ基因已整合到蓝藻基因组DNA上;蛋白质印迹表明mMT-Ⅰ已在蓝藻中表达;ELISA结果显示mMT-Ⅰ在蓝藻中的表达量约为800 μg/g.     

Cyanovirin-N蓝藻的筛选及其分子鉴定

目的:从实验室培养的自牛蓝藻中筛选出含有能编码抗病毒蛋白(cyanovirin-N,CV-N)基因的藻株并对其进行分子鉴定.方法:应用PCR技术和自行设计的特异性引物从80株蓝藻中筛选目标藻株,通过克隆、测序后,进行blast比对,经在线生物信息学软件预测该抗病毒蛋白CV-N的一级,二级,三级结构,并推测该基因序列编码的蛋白的抗病毒潜能.结果:筛选出藻株RZHA4.其所含的CV-N基因与已报道的CV-N基因有97%的相似性.结论:经16S rRNA-PCR和序列分析,该藻株与蓝藻Nostocaceae有99%的相似性,为一在实验室常规培养条件下生长良好的念珠藻(Nostoc),有可能成为新的CV-N生产藻株.     

印度节旋藻TJSD rpoC1基因部分序列的克隆与分析

[目的]为进一步明确TJSD藻株的分类学地位,寻找用于螺旋藻、节旋藻分类的新靶标分子。[方法]采用PCR技术对印度节旋藻TJSD藻株的rpoC1基因进行扩增,利用相关生物信息学数据库及软件对其序列进行了分析。[结果]获得的rpoC1基因编码区片段长度为966 bp,GC含量为47.41%,由此推导的氨基酸的理论相对分子质量为29.16 kD,其中酸性、碱性、疏水性氨基酸的比例分别为14.29%、16.77%、42.86%,与其它蓝藻同源序列的相似度在76%~99%之间。该藻株与Arthrospira sp.PCC8005藻株的遗传距离仅为0.001,在NJ树中聚在一起,且得到了100%的支持率,与蓝藻中其它属明显分为了不同的类群。[结论]TJSD为节旋藻属且rpoC1基因序列可在属及其以上水平用于节旋藻系统发育分析。     

鱼腥藻PCC7120中琥珀酸半醛脱氢酶的初步表征及结构分析

蓝藻琥珀酸半醛脱氢酶催化琥珀酸半醛到琥珀酸的转化,使得蓝藻的三羧酸循环变得完整。BLAST序列分析预测鱼腥藻PCC7120中all3556基因编码琥珀酸半醛脱氢酶。为了证实all3556基因编码蛋白的催化功能,构建了p ET28a-all3556表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)菌体中进行重组蛋白诱导表达;利用镍亲和层析方法对all3556蛋白进行了分离纯化。酶动力学测试表明all3556蛋白是一个NADP+-依赖型的琥珀酸半醛脱氢酶。生物信息学分析发现all3556蛋白和其他来源的琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列具有一定的同源性,在催化中心的氨基酸残基高度保守。     

T7 RNA聚合酶基因表达系统在鱼腥藻7120中构建及hG-CSF的表达

外源基因的表达效率低是蓝藻基因工程发展的瓶颈之一,T7 RNA聚合酶表达系统实现了大肠杆菌中外源基因的高效表达,蓝藻与大肠杆菌同为革兰氏阴性菌,具有较高的遗传同源性,在蓝藻中构建T7 RNA聚合酶表达系统有可能提高外源基因在蓝藻中的表达效率。为了在鱼腥藻7120中构建T7 RNA聚合酶表达系统,采用重叠延伸PCR技术和酶切连接等方法构建能够表达T7 RNA聚合酶的定点整合载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2以及由T7启动子驱动hG-CSF基因表达的穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF;采用电击转化法将定点整合载体导入野生型鱼腥藻中,通过三亲接合的方法将穿梭表达载体转入已定点整合T7 RNA聚合酶的转基因鱼腥藻中。利用PCR技术鉴定外源基因在蓝藻中的存在;RT-PCR方法检测外源基因在蓝藻中的转录情况;Western blotting实验检测外源基因在蓝藻中的蛋白表达情况。结果表明两种载体构建成功,T7 RNA聚合酶基因和hG-CSF基因被转入鱼腥藻中,两个基因均在藻中表达,T7 RNA聚合酶表达系统在鱼腥藻中构建成功,与传统蓝藻表达系统相比,文中在鱼腥藻中构建的T7表达系统使hG-CSF基因的表达量提高2倍。该表达系统将为蓝藻基因工程的应用提供更优的工具,将促进蓝藻作为底盘细胞在合成生物学等领域的发展。     

鱼腥藻Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

随着更多蓝藻全基因组序列测定完成,蓝藻基因工程研究现已进入后基因组时代。2001年Kaneko等完成了鱼腥藻7120全基因组序列测定,随后人们利用生物信息学的方法对其中一些基因的功能进行了预测,包括Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）基因,但该基因是否编码Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶及该产物的相关酶学特性至今尚未见报道。通过PCR克隆到鱼腥藻7120中预测的Ⅱ型FBA基因,插入到质粒pET-32a的相应位点,构建成原核表达载体pET-FBA-Ⅱ。蛋白电泳结果显示,重组蛋白的表达量占总蛋白含量的23．4％,与蛋白分子标记相比,其分子量约为40kDa。酶学活性测定结果表明,其蛋白粗提物的比活力为11．8U（mgprotein）^-1,具有标准Ⅱ型FBA活性。证实了Cyanobase中关于该基因功能的预测,也为进一步研究该基因表达产物的生理生化特性及功能提供了重要资料。     

席藻ITS序列拷贝类型及进化关系分析

由于协同进化未完成,蓝藻的16S-23S rDNA基因间隔序列(ITS)存在多种拷贝类型,目前蓝藻ITS序列的拷贝类型分布以及演化规律尚未研究清楚。该文采用本地采集的席藻属样品,测定其ITS序列,并结合基因库中已有的席藻ITS序列,对席藻属蓝藻ITS序列拷贝类型及其之间的进化关系进行探讨。结果显示,席藻属ITS序列的PCR产物有两种情况,即单一条带(仅出现ITS-IA或ITS-I型)和两条条带(同时出现ITS-IA和ITS-N型),其中以单一条带的ITS-IA型最为普遍;在基于ITS序列的系统发生树中,ITS-IA型和ITS-I型均各自聚为一个组群,且ITS-IA型的组群节点出现较早,表明席藻属ITS-I型极有可能是由其原来的ITS-IA型缺失tRNAAla编码区进化而来,ITS-IA型应为席藻ITS序列的基本结构。     

蓝藻非编码RNA Yfr7的生物学特征分析

Yfr家族是广泛存在于蓝藻基因组中的一类非编码RNA,在细胞代谢和环境适应方面发挥重要作用。文中选取Yfr7作为研究对象,首先根据序列特征确定Yfr7的二级结构,然后结合动态规划和自由能的计算方法预测Yfr7的调控基因,从细胞定位、分子功能和调控路径三方面对这些基因进行分析,以快速发现Yfr7的功能,最后通过构建进化树来揭示Yfr7的遗传特征。结果表明:Yfr7拥有独立的启动子区和操纵子,通过保守片段5'-GTGCTCTGATCTGACT-3'与目标mRNA序列互补来调控特定基因的表达;目标基因包括看家基因和酶基因,这些目标基因的功能说明Yfr7广泛参与细胞的次级代谢;进化树聚类表明Yfr7与菌株光照类型有关,参与蓝藻最重要的光合反应;Yfr7与6S RNA在序列、结构和遗传距离上都高度一致,推测可能来自同一个祖先。这些研究结果可为进一步开展相关实验研究提供理论基础。