T7 RNA聚合酶基因表达系统在鱼腥藻7120中构建及hG-CSF的表达

外源基因的表达效率低是蓝藻基因工程发展的瓶颈之一,T7 RNA聚合酶表达系统实现了大肠杆菌中外源基因的高效表达,蓝藻与大肠杆菌同为革兰氏阴性菌,具有较高的遗传同源性,在蓝藻中构建T7 RNA聚合酶表达系统有可能提高外源基因在蓝藻中的表达效率。为了在鱼腥藻7120中构建T7 RNA聚合酶表达系统,采用重叠延伸PCR技术和酶切连接等方法构建能够表达T7 RNA聚合酶的定点整合载体pEASY-T1-F1-TacT7RNAPCmR-F2以及由T7启动子驱动hG-CSF基因表达的穿梭表达载体pRL-T7-hG-CSF;采用电击转化法将定点整合载体导入野生型鱼腥藻中,通过三亲接合的方法将穿梭表达载体转入已定点整合T7 RNA聚合酶的转基因鱼腥藻中。利用PCR技术鉴定外源基因在蓝藻中的存在;RT-PCR方法检测外源基因在蓝藻中的转录情况;Western blotting实验检测外源基因在蓝藻中的蛋白表达情况。结果表明两种载体构建成功,T7 RNA聚合酶基因和hG-CSF基因被转入鱼腥藻中,两个基因均在藻中表达,T7 RNA聚合酶表达系统在鱼腥藻中构建成功,与传统蓝藻表达系统相比,文中在鱼腥藻中构建的T7表达系统使hG-CSF基因的表达量提高2倍。该表达系统将为蓝藻基因工程的应用提供更优的工具,将促进蓝藻作为底盘细胞在合成生物学等领域的发展。     

WST-8方法用于蓝藻细胞活力的检测

作为重要的模式生物,蓝藻活细胞数量的测定方法应用非常广泛。本研究尝试将用于哺乳动物细胞的快速活力检测方法 WST-8方法用于蓝藻的检测。首先考察WST-8法与传统的蓝藻细胞计数法的相关性从而判断WST-8法应用的可行性,然后优化检测条件,考察检测波长、是否光照、孵育温度、孵育时间以及底物加入量对测定结果的影响。结果表明,细胞密度与WST-8方法测定的吸光度呈线性(r~2=0.996 7),此方法可用于集胞藻6803的细胞活力测定。最佳检测波长为457 nm,在25℃、30℃、37℃3个温度下,随温度升高,底物还原量增多,随孵育时间增加,产物逐渐增加,在0～120 min内呈现良好的线性关系,当底物加入量在2～10μL范围内,产物量随底物量增加而增加,当底物量大于10μL后产物量不再增加。因此,建议的检测条件为在30℃时,取100μL蓝藻培养液(浓度为1×10~7～6.4×10~7 cell/mL)于96孔板孔中,加入10μL WST-8试剂,光照恒温摇床孵育120 min,测定457 nm吸光度。