柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示:从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。     

巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

为构建巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子倾卵囊cDNA表灰文库,从E.maxima孢子化卵囊中提取总RNA,以总RNA为模板、λTriplex2TM为栽体,利用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA表达文库.经测定构建的E.maxima cDNA表达文库的原始文库容量为1×106 pfu/ml,扩增后的文库滴度为5×1010pfu/ml,重组率为95%,插入片断主要集中在0.5～1kb之间.根据已知序列设计引物,能从文库中扩增出编码E.maxima免疫球蛋白重链结合蛋白的基因序列片段.结果 表明所构建的E.maxima cDNA表达文库质量良好,为克隆、筛选E.maxima的功能性基因奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫HSP基因的克隆、表达及鉴定

为研究柔嫩艾美耳球虫热激蛋白(Heat shock proteins,HSPs)的生物学特性,应用RACE和RT-PCR技术,从柔嫩艾美耳球虫子孢子中首次克隆获得了EtHSP的全长cDNA(GenBank Accession No.FJ911605)。EtHSP包含一个1455 bp的开放阅读框,编码484个氨基酸,预测表达蛋白的分子量大小为53.5 kD。应用Real-time PCR对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析,发现该基因在子孢子阶段的表达明显高于其他阶段。同时,构建了原核表达重组质粒pET28a(+)-EtHSP,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,重组质粒pET28a(+)-EtHSP在大肠杆菌中以包涵体形式表达,经1 mmol/L IPTG诱导6 h后的表达量最高,该蛋白可被抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株的分离与鉴定

目的 分离并鉴定安徽肥西病鸡盲肠内的柔嫩艾美耳球虫.方法 通过雏鸡进行单卵囊接种与增殖试验,对所获卵囊用形态学方法进行初步鉴定;运用PCR方法扩增该分离株的ITS-1基因序列,并与相关序列进行比对、构建系统进化树.结果 该球虫分离株孢子化卵囊的平均大小为21.1 μm ×18.0 μm,卵形指数为1.17,潜隐期为140 h;其ITS-1基因序列与柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)GQ856310相似性达98.2％,二者的亲缘关系非常接近.结论 该球虫分离株为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella),暂命名为柔嫩艾美耳球虫安徽肥西(AHFX)株.     

柔嫩艾美耳球虫基因在丝状体蓝藻中的克隆*

以纯化的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊为模板 ,根据已知的序列设计一对引物 ,用RT PCR方法扩增出球虫的SO7基因 ,通过三亲接合转移、新霉素筛选、序列分析等方法得到了转球虫基因工程蓝藻。这为球虫基因在蓝藻中表达奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

用建立表达性文库的方法 ,构建了Eimeriatenella孢子化卵囊噬菌体ZAP表达性cDNA文库。首先用TRIzol试剂盒从E .tenella孢子化卵囊中提取总RNA ,再用Oligo(dT)₁₂纤维素柱从总RNA中分离mRNA ,以mRNA为模板 ,Oligo(dT)₁₈Linker Primer为引物 ,反转录合成cDNA第一链 ,再在DNA聚合酶Ⅰ作用下置换合成第二链cDNA。cDNA第二链合成后用PfuDNA聚合酶补平XhoⅠ位点 ,再与EcoRⅠAdapters连接 ,经XhoⅠ酶切后 ,凝胶电泳回收 500bp～4.0kp之间的cDNA片段 ,纯化后的双链cDNA与载体ZAPExpressvector连接。体外包装后得到E .tenella孢子化卵囊的cDNA表达性文库 ,经测定该文库的容量为 6×10⁶ ,扩增后文库的滴度为 1×10¹¹ Pfu mL ,经PCR测定 ,该文库的重组率为 96%。     

柔嫩艾美耳球虫新基因的生物信息学分析与克隆表达

为了研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的两个主要入侵发育阶段——子孢子和裂殖子的差异基因,根据已报道的子孢子与裂殖子差异的ESTs序列,应用RACE技术克隆获得了子孢子阶段差异表达的新基因全长cDNA序列,命名为ZL583.该基因全长为862 bp,开放阅读框(ORF)为486 bp,编码161个氨基酸,编码蛋白的分子量约为16.9 kD,利用生物信息学分析软件,分析新基因所编码蛋白的性质、定位、结构等特征.利用荧光定量PCR对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段该基因的表达量进行分析显示,子孢子阶段的表达高于其他发育阶段.将ZL583克隆于pET-28a中构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达,获得重组蛋白分子量约23 kD.免疫印迹分析显示该重组蛋白可与兔抗子孢子血清发生特异性反应,表明该蛋白具有较好的反应原性.该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础.     

干旱胁迫下黄檗幼苗cDNA消减文库的构建和分析

以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。将其进行同源性分析, 划分为16类。获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。     

干旱胁迫下黄檗幼苗cDNA消减文库的构建和分析

以干旱胁迫下的黄檗幼苗cDNA 为tester, 正常生长的黄檗幼苗cDNA为driver, 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了干旱胁迫下黄檗幼苗的消减文库并对其进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取20个阳性克隆, 提取质粒进行酶切和PCR鉴定, 显示文库克隆的重组率大于95%, 插入片段大小大部分集中在300~800bp之间。随机挑取816个克隆进行测序, 得到265个基因。将其进行同源性分析, 划分为16类。获得了热激蛋白70、脱水响应蛋白(RD22)、通用胁迫蛋白、金属硫蛋白(MTII), 晚期胚胎丰富蛋白(LEA14)等44种与干旱胁迫相关的基因,它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除等方面。本研究为抗逆基因克隆和系统研究干旱胁迫下黄檗基因的表达奠定了重要的理论基础。     

柔嫩艾美耳球虫基因在丝状体蓝藻中的克隆

以纯化的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵巢为模板,根据已知的序列设计一对引物,用RT－PCR方法扩增出球虫的S07基因,通过三亲接合转移、新霉素筛选、序列分析等方法得到了转球虫基因工程蓝藻。这为球虫基因在蓝藻中表达奠定了基础。     

用改良消减杂交结合选择性PCR法构建老年性白内障消减cDNA文库

为构建含较多大片段的高质量的老年性白内障消减cDNA文库 ,利用生物素标记、磁珠分离的改良消减杂交法获得差异cDNA .利用选择性PCR法扩增其中大片段差异cDNA ,将其与T 载体进行T A连接并转化入大肠杆菌 ,成功构建老年性白内障消减cDNA文库 .共获得 4 0 0 0余个克隆 ,随机挑取的 2 2个克隆中 ,≥ 10 0 0bp的片段有 7个 ,占 31 8% ,≥ 75 0bp有 15个 ,占 6 8 2 % .将≥ 75 0bp的 15个克隆进行反向点杂交 ,排除其中假阳性克隆 ,阳性克隆经测序并与GenBank比较 ,得到 6个已知基因、1个新基因 ,6个已知基因中 4个为全长基因 ,说明所得cDNA片段较大 ,文库质量较高 .改良消减杂交法结合选择性PCR法可以快速有效地获得大片段高质量的消减cDNA文库 ,为进一步筛选、鉴定老年性白内障致病相关基因奠定了基础     

抑制消减杂交及其应用

抑制消减杂交(Suppressionsubtractivehybridization,SSH)是以消减杂交为基础结合抑制PCR方法发展起来的分离克隆差异表达基因的一种策略。该方法具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点。主要介绍其原理、方法及其应用,并对方法的优缺点和应用前景作分析。     

差减抑制杂交技术在植物研究中的应用

差减抑制杂交技术在医学研究中应用较多,而在植物研究中的应用较少,近几年有所增加。本文介绍了目前差减抑制杂交技术在植物发育、逆境胁迫或人为诱导条件下差异基因表达以及不同组织中差异基因表达和突变等研究方面的应用。随着研究的不断深入,差减抑制杂交技术将在植物新基因的发现和克隆中发挥更大作用。     

抑制性消减杂交技术在寄生虫学研究中的应用

抑制性消减杂交技术(SSH)是一种适用于分离两个遗传背景相关的DNA样品之间差异从而表达基因的方法。目前,该技术在寄生虫学研究中的应用不是很多,主要应用在寻找与寄生虫不同发育阶段相关的差异表达基因和与寄生虫抗药性相关的差异表达基因以及其他相关基因的研究,如与不同虫株、不同宿主、或性别差异相关的基因。本文从这几个方面综述了SSH技术在寄生虫学研究中的进展情况。了解这些信息,有助于将来更好地利用该技术研究寄生虫学,为寄生虫病的防治提供一定的理论依据。     

Subtractive screening of genes involved in cellular senescence

We attempted to identify the genes involved in cellularsenescence, telomere maintenance and telomerase regulationthrough subtractive screening of cDNA libraries prepared froma human lung adenocarcinoma cell line A549 and its sublinesnamed A5DC7, CK and AST-9. Cell phenotypes of A5DC7, CK andAST-9 are normal cell-like, cancer cell-like and intermediate,respectively. These cell lines have different phenotypes interms of telomerase activity and telomere maintenance, andthus are thought to be useful for identifying the genesinvolved in cellular senescence and telomerase regulation. In this study, we identified 86 independent cDNA clones bysubtractive screening. Among these cDNA clones, subtractingA5DC7 cDNAs from A549 cDNAs and CK cDNAs gave 7 and 3 cDNAclones which highly and specifically expressed in tester celllines. Genes corresponding to these 10 cDNA clones mightparticipate in maintaining cancer-cell phenotypes. As aresult of database searching, each four of A549 specific cDNAclones are found to correspond to known cDNAs. Each two ofA549 specific and two of CK specific cDNA clones have highhomology to independent ESTs. Sequences having homology toeach one of A549 specific and one of CK specific cDNA cloneshave not been deposited in the Genbank database, indicatingthat these two cDNA clones are part of novel genes. Weanticipate that their involvement in telomerase regulationand/or senescence program can be clarified by functionalanalysis using each full-length cDNA.     

消减免疫法在单克隆抗体制备中的应用

单克隆抗体是现代生命科学研究的重要工具。常规的杂交瘤技术通常并不能获得特定目的抗原的单克隆抗体,而消减免疫法可在一定程度上弥补这一缺陷。消减免疫利用特殊的免疫耐受途径来大幅增加目的单抗的产生数目。它建立在宿主动物对免疫显性抗原或非目的抗原（耐受原）耐受的基础上,宿主动物可通过高区带耐受、新生期耐受和药物介导的耐受等3种方法获得耐受,然后再对已耐受的动物接种目的抗原（免疫原）,特异性抗体便随之产生。近20年来,用消减免疫法成功地制备了多种独特抗体。简要阐述了可用消减免疫法获得的单克隆抗体的制备。     

差减杂交方法的原理和应用

本文结合胡杨盐诱导基因和盐抑制基因的筛选,介绍了差减杂交（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）技术的试验原理,设计思想和应用方法。