蓝杆藻ATCC51142中琥珀酸半醛脱氢酶的原核表达及生化表征

【背景】蓝藻中生成琥珀酸的三羧酸循环途径与其他物种不同。由于α-酮戊二酸脱羧酶和琥珀酸半醛脱氢酶的存在使得蓝藻的三羧酸循环途径变得完整。琥珀酸半醛脱氢酶催化琥珀酸半醛氧化为琥珀酸,在蓝藻中广泛存在。【目的】克隆、表达和纯化蓝杆藻ATCC51142中cce4228基因编码蛋白,并对其进行生化表征。【方法】以蓝杆藻ATCC51142基因组为模板克隆得到cce4228基因,将其插入到原核表达载体pET-28a上,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行异源表达,利用Ni-NTA树脂纯化cce4228蛋白。运用紫外分光光度法和生物信息学方法表征重组cce4228蛋白生化特性。【结果】构建了pET-28a-cce4228重组表达质粒,重组cce4228蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达,获得了纯度大于90%的cce4228蛋白。酶动力学测试和生物信息学分析结果显示,cce4228蛋白是一个NADP+-依赖型的琥珀酸半醛脱氢酶。【结论】蓝杆藻ATCC51142中cce4228基因编码一个偏好NADP+辅因子的琥珀酸半醛脱氢酶,cce4228蛋白的生化表征结果为进一步深入研究cce4228蛋白的结构功能关系及催化机制奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌γ-氨基丁酸代谢途径相关功能基因的克隆、表达及同源性分析

γ-氨基丁酸代谢旁路作为三羧酸循环的一个分支,在真核、原核生物中广泛存在。在这条代谢途径中,涉及γ-氨基丁酸分解代谢的主要有两种酶:一种是γ-氨基丁酸转氨酶,能将γ-氨基丁酸转变成琥珀酸半醛;另一种是琥珀酸半醛脱氢酶,该酶能将琥珀酸半醛氧化形成琥珀酸,后者进入三羧酸循环。从国内分离得到的苏云金芽胞杆菌G03菌株中克隆了gabT和gabD基因。其中gabT基因含有1440bp,编码一个大小为52.6kD的蛋白质,而gabD基因大小为1449bp,编码一个52.2kD的蛋白质。这两个基因都分别在大肠杆菌中进行了表达和纯化。通过酶活测定结果表明,GabT和GabD蛋白分别呈现出γ-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶的活性。氨基酸序列同源性比对分析发现,这两个蛋白质在蜡样芽胞杆菌群(B.cereus group)中具有较高的相似性,而与枯草芽胞杆菌的相似性较低则分别为58%、51%。为进一步深入研究γ-氨基丁酸代谢旁路在苏云金芽胞杆菌中的生物学功能及其转录调控机制奠定了基础。     

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式.采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测.获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3’端编码区2118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基.核苷酸序列与牛的IGF-IR( XM606794.3)基因同源性为98％,相应的氨基酸序列同源性为99％.SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域.半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达.     

鱼腥藻PCC7120基因a115292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶（biliprotein lyase）编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻（Anabaena）PCC7120中获取了同源基因all5292和alt0647。同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53．4％和61．4％。随后,对这两个基因进行了初步研究。结果显示：All5292和Alr0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白（phycocyanin）或藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin）β亚基上的功能。通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索。结果表明：all5292和alr0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达。     

鱼腥藻PCC7120基因all5292和alr0647的初步研究

通过BLAST软件分别对藻胆蛋白裂合酶(biliprotein lyase)编码基因cpcS和cpcT进行同源搜索分析,在鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中获取了同源基因all5292和alt0647.同源分析发现,这两个基因所编码氨基酸序列与其相对应的裂合酶氨基酸序列相似程度分别达到53.4%和61.4%.随后,对这两个基因进行了初步研究.结果显示:All5292和Air0647无论单独还是共同表达均没有裂合酶催化藻蓝胆素PCB结合到藻蓝蛋白(phycocyanin)或藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin)B亚基上的功能.通过在不同生理条件下对鱼腥藻PCC7120的培养,还对这两个基因的调控表达进行了初步的探索.结果表明:all5292和alt0647的表达与氮源的缺乏与否有联系,在氮胁迫条件下两个基因均进行了转录而在氮源充足的情况下则没有表达.     

甘蔗天冬氨酰半醛脱氢酶基因的电子克隆与分析

应用电子克隆技术,以水稻EF576477序列为探针,获得了甘蔗天冬氨酰半醛脱氢酶基因（aspartate．semialdehydedehy—drogenase,ASADH）的一条cDNA全长序列,命名为ScASADH。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、疏水性／亲水性、高级结构及功能域等方面进行预测和分析。结果表明：该基因全长1711bp,包含一个1128bp的开放阅读框,编码375个氨基酸,该基因编码蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,存在信号肽,二级结构原件多为无规卷曲,含有多个保守功能域,主要功能为翻译。电子表达分析结果显示,该基因在甘蔗根尖、幼苗、花序、叶片和茎中组成型表达,其中在茎中的表达量比其他组织类型中表达量高。该基因的表达受葡萄糖杆菌和赤腐病菌的调控。     

甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶SbSSADH基因克隆及原核表达

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)代谢旁路是TCA循环的一个代谢支路,广泛存在于动植物和微生物中,植物GABA代谢旁路与植物生物和非生物胁迫响应相关。琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)是GABA旁路的一个关键酶,对GABA途径在生物体内发挥功能起着至关重要的作用。通过检索Maize GDB和Gramene数据库获得甜高粱Sb SSADH基因信息,利用同源克隆的方法获得了甜高粱Sb SSADH基因。序列分析结果表明,Sb SSADH基因与玉米、甘蔗在核酸序列的相似度为94.77%,但前端约200 bp的信号肽部分差异较大。通过以p ET-28a为表达载体构建Sb SSADH原核表达系统,Rosetta菌株为表达菌,表达出约50 k D的SSADH蛋白,将纯化的蛋白进行酶活分析,纯化蛋白具有琥珀酸半醛脱氢酶活性,并且受酶抑制剂ATP和AMP的抑制。     

美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

旨在通过5’-RACE获得美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,为进一步研究其功能奠定基础.通过3’-RACE技术,PCR扩增获取编码美洲大蠊GAPDH蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法推导出该序列编码的氨基酸序列及其理化性质;预测信号肽、蛋白疏水性、可溶性、跨膜区结构、二级结构、三级结构,并构建系统发育树;构建原核表达载体pET28a-GAPDH,IPTG诱导重组蛋白表达,并用Histag抗体Western blotting验证.结果显示,美洲大蠊GAPDH基因,其完整阅读框含999个碱基,编码332个氨基酸.序列分析显示,该蛋白与家蚕GAPDH相似性为89％,具有GAPDH保守功能域,经IPTG诱导获得重组蛋白.     

甘菊BADH基因cDNA的克隆及在盐胁迫下的表达

利用PCR、RT—PCR和PCR—RACE技术,从菊科植物甘菊（Dendranthema lavandulifolium）中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因的同源基因,分别命名为DlBADH1和DlBADH2,GenBank登录号分别为DQ011151和DQ011152。DlBADH1的cDNA全长1821bp,其开放阅读框编码503个氨基酸的蛋白质;DlBADH2全长1918bp,编码506个氨基酸的蛋白质。两个基因核苷酸序列的同源性为97％,推导的氨基酸序列的同源性为98％。与已发表的其它植物BADH基因氨基酸序列的同源性在64％以上。在推导的氨基酸序列中,均含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VTLELGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）。在推导的氨基酸序列的系统关系中,甘菊位于其它双子叶植物和单子叶植物之间,与其植物分类的系统关系相吻合。RT—PCR—Southern半定量表达分析表明,甘菊BADH基因家族中存在表达受盐诱导的成员。     

甘菊BADH基因cDNA的克隆及在盐胁迫下的表达

利用PCR、RT-PCR和PCR-RACE技术,从菊科植物甘菊(Dendranthema lavandulifolium)中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的同源基因,分别命名为DlBADH1和DlBADH2,GenBank登录号分别为DQ011151和DQ011152.DlBADH1的cDNA全长1821 bp,其开放阅读框编码503个氨基酸的蛋白质;DlBADH2全长1918 bp,编码506个氨基酸的蛋白质.两个基因核苷酸序列的同源性为97%,推导的氨基酸序列的同源性为98%.与已发表的其它植物BADH基因氨基酸序列的同源性在64%以上.在推导的氨基酸序列中,均含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽(VTLELGGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸残基(C).在推导的氨基酸序列的系统关系中,甘菊位于其它双子叶植物和单子叶植物之间,与其植物分类的系统关系相吻合.RT-PCR-Southern半定量表达分析表明,甘菊BADH基因家族中存在表达受盐诱导的成员.