正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

永瓣藤ISSR—PCR反应体系的建立与优化

以永瓣藤基因组DNA为模板,通过单因子、双因子实验研究了ISSR反应体系中主要成分(Mg2 、dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶)以及热循环参数(退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间)对扩增结果的影响,并找出各自的最适条件,建立了适合永瓣藤ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25 μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.5 mmol/L Mg2 、200 μmol/L dNTP、0.5 μmol/L引物、50 ng 模板、2 U TaqDNA聚合酶.扩增程序为94 ℃预变性5 min,然后进行35个循环:94 ℃变性30 s,复性1 min,72 ℃延伸1 min,循环结束后72 ℃延伸7 min.这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术进行永瓣藤鉴定及种质遗传多样性分析提供了一个标准化程序.     

药用植物草珊瑚RAPD扩增条件优化

采用CTAB-DNA提取方法,从草珊瑚植物的嫩叶中提取总DNA。以此DNA为模板,优化了草珊瑚RAPD-PCR的反应条件。结果表明,PCR扩增体系最适宜的条件为:反应体积25μL,内含2.5mmol/L Mg2+、1.0UDNA聚合酶、0.4μmol/L引物、60ng模板DNA和0.16mmol/L dNTP。扩增程序为:94℃预变性2min;94℃变性30s,37℃复性30s,72℃延伸80s,40个循环;72℃延伸10min;4℃保存10min。     

云南松SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适宜云南松SSR-PCR的反应体系和扩增程序,利用近缘种火炬松的引物,采用正交设计L16(45)对云南松SSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了适于云南松的SSR反应体系.在10μL的反应体系中,模板DNA的用量为30.0 ng,Taq DNA聚合酶的用量为1.0 U,Mg2+的浓度为2.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.4 mmol/L,引物的浓度为0.2 μmol/L.扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,48℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环;72℃延长10 min,4℃保存.最后利用1个居群对该体系进行稳定性验证,结果可用于云南松SSR标记的研究.     

冬瓜和节瓜DNA提取及RAPD反应体系优化

以8份冬瓜和节瓜为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,采用正交试验设计,对冬瓜和节瓜RAPD条件进行了优化,建立了最佳反应体系:25μL反应体系中含1×buffer,模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶的浓度分别为20 ng、2.0mmol/L、0.24 mmol/L、0.3μmol/L和1.0 U。PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,36.9℃退火45 s,72℃延伸1.5min,共40个循环;72℃延伸10 min,12℃保存。     

葡萄ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计L9(34)对影响葡萄ISSR-PCR反应体系的4个因素(dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA)在3个浓度水平上进行试验,并通过直观分析初步确定其反应体系;在此基础上,通过单因素试验探讨了dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA、退火温度及循环次数等因素或条件对葡萄ISSR-PCR扩增结果的影响,确定最佳反应水平。最终建立了葡萄ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:在25μL的反应体系中,dNTP浓度0.2 mmol/L,TaqDNA聚合酶的用量0.5 U,引物浓度0.4mmol/L,DNA模板用量40 ng。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min 30 s,40次循环;最后72℃延伸10 min,10℃保存。     

正交设计优化玉米SSR-PCR反应体系的研究

为建立适宜玉米SSR-PCR的反应体系和扩增程序,利用正交设计L16(45)表,对反应体系的模板DNA、dNTPs、Primers、Taq DNA聚合酶的浓度进行4因素4水平优化筛选和扩增程序的优化,确立了最优反应体系和扩增程序.即在10 μL体系中,模板DNA 20 ng,1×PCR buffer,dNTPs 62.5 pmol/μL,Primers0.25 pmol/μL,Taq DNA polymerase 0.5 U.反应程序为:94℃预变性5 min:94℃变性45 s,60℃退火45 s,72℃延伸1 min,32个循环;72℃延伸5 min,4℃保存.使用300对SSR引物对重组近交系的两亲本扩增,筛选出条带清晰,有差异的引物94对,用于基因连锁图谱构建和QTL定位.     

红锥基因组RAPD反应体系的建立和优化

以红锥(Castanopsis hystrix A.DC.)嫩叶为材料,应用改良的CTAB方法成功提取了红锥基因组DNA,并对影响随机扩增多态DNA(RAPD)反应的各因素进行了优化,建立了红锥RAPD的优化反应体系及程序.在25μl反应体系中,模板DNA 0.8 ng μl-1,10×Buffer 2.5 μl,Mg2 2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.8 U,dNTPs 0.35 mmol/L,随机引物S42 0.28 μmol/L.PCR循环程序为:94℃预变性3 min,然后94℃ 30 s,39℃ 1 min,72℃ 2 min,35个循环,最后72℃延伸10 min,4℃保存.     

杨梅RAPD-PCR体系的正交优化研究

以杨梅DNA为模板,对影响杨梅RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立杨梅RAPD反应的最佳体系。通过采用正交试验设计的方法,对杨梅RAPD-PCR条件进行了优化,结果表明最佳的杨梅RAPD-PCR的反应体系(20μl)中含有1×buffer,1.0U TaqDNA聚合酶,3.0mmol/L MgCl2,0.30mmol/L dNTPs,1.5μmol/L引物和模板DNA 30-40ng。适宜的扩增条件为94℃预变性3min,再进入38个PCR循环(94℃变性30s,38℃退火30s,72℃延伸90s),72℃延伸7min,4℃保存。     

增强UV-B辐射对小麦幼苗基因组DNA的影响及RAPD分析体系的建立

采用改进的CTAB法提取小麦总基因组DNA,并以之为模板对RAPD反应体系中的一些重要参数进行梯度试验,建立了一套适合本研究的最佳反应体系。即25μL反应体系:模板DNA 20 ng、引物浓度0.5μmol/L、dNTPs浓度200μmol/L、Taq酶0.750 U。反应程序:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,38℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。此外,利用扩增结果稳定的引物对正常光照组及增强UV-B辐射处理组的小麦DNA进行RAPD分析。结果表明,增强UV-B辐射处理组的DNA,经引物S22、S40扩增后分别出现了分子量为2 144 bp和2 082 bp的差异条带,这能否从一定程度上揭示UV-B对植物造成损伤的分子生物学机制,还有待进一步的研究。     

狭边大叶藓（Rhodobryum ontariense）ISSR-PCR反应体系的建立与优化

研究目的是获得适用于狭边大叶藓（Rhodobryum ontariense）遗传多样性研究的ISSR—PCR反应标准化程序。通过单因素试验设计,对Mg^2＋、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板、引物浓度,以及退火温度、循环次数等影响ISSR扩增的主要因素进行了研究和优化。结果表明,UBC808、UBC811、UBC812、UBC825、UBC826、UBC841、UBC888及UBC891引物适用于该研究;20μL ISSR—PCR最适反应体系包括：6ngDNA模板、0．4μmol／L引物、2．25mmoL／LMg^2＋、0．6U Taq DNA聚合酶、0．4mmol／LdNTPs。扩增程序为：94℃预变性4min;然后94℃变性1min,48～50℃（根据不同引物确定）复性2min,72℃延伸1min,共进行40个循环;最后,72℃延伸7min,4℃保存。     

濒危植物峨眉野连ISSR反应体系的建立与优化

针对峨眉野连ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系,为进一步研究峨眉野连的种质资源遗传多样性奠定基础。通过筛选引物并设定影响峨眉野连ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测其不同反应体系的扩增效果,分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立峨眉野连ISSR-PCR稳定可靠的反应体系。首次建立了可用于峨眉野连ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25μLPCR反应体系中,内含1×PCRBuffer,1.5mmol/LMg2+,200μmol/LdNTP,0.3μmol/L引物,80ng模板,1.0UTaqDNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性5min,然后进行35个循环:94℃变性30s,(据不同引物的退火温度)复性60s,72℃延伸90s,循环结束后72℃延伸7min,4℃保存。所建立的峨眉野连ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,可以较好地应用于峨眉野连的种质资源多样性及居群鉴别的研究。     

栝楼ISSR-PCR体系的正交优化

目的：建立栝楼最佳ISSR-PCR正交优化体系,为开展栝楼ISSR分子标记奠定技术基础。方法：采用正交试验设计对影响栝楼ISSR-PCR扩增的重要参数（DNA模板、MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶）进行优化试验,同时进行不同温度梯度试验和ISSR体系筛选。结果：最佳的栝楼ISSR-PCR的反应体系（20μl）为：30ng模板DNA,2.0mmol/L MgCl2,0.3mmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶;退火温度为52℃-55℃;扩增反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,52℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环;72℃延伸7min;4℃保存。结论：建立了栝楼的最佳ISSR反应体系,为栝楼种质鉴定提供了更客观可靠     

珍稀植物杨叶肖槿ISSR体系建立及检测

针对珍稀植物杨叶肖槿ISSR反应的特点,建立了适用于杨叶肖槿遗传多样性研究的ISSR最适反应体系,具体包括:2.0μL 10×Buffer,27.5ng的模板DNA,2.0μL的dNTP,1U的Pyrobest DNA酶,1.25μmol/L的引物;最佳反应程序为94℃预变性5min,然后94℃变性1min,49℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。应用该优化的反应体系筛选出了10条稳定性强、清晰度高而且表现出一定多态性的ISSR引物,并对杨叶肖槿进行了检测,获得了清晰稳定的扩增图谱。     

正交设计优化紫萼藓科植物的ISSR-PCR反应体系

目的:建立紫萼藓科(Grimmiaceae)植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:通过L16(45)正交试验,研究了dNTP浓度、镁离子浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响。结果:建立了紫萼藓科ISSR-PCR反应的最佳反应体系,其中dNTPs浓度为0.8mmol/L、Mg2+浓度为3.0mmol/L、模板为15ng、引物浓度为1.4μmol/L、Taq酶量2U,总体积为25μl。反应程序为:扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～52℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min;4℃保存。采用引物UBC812等均能够得到有效扩增。结论:该优化体系的建立为下一步对紫萼藓进行ISSR分子标记奠定了基础。     

无距虾脊兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交实验设计的方法,对珍稀植物无距虾脊兰ISSR-PCR反应的5个因素（Mg²⁺、dNTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶）4个水平进行试验,并通过梯度PCR实验确定引物的最佳退火温度和循环次数,最终确定无距虾脊兰的最佳反应体系为：25 μL的体系中含3.0 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.3 mmol·L^-1dNTP、0.4 μmol·L^-1引物、2.5 ng·μL^-1模板DNA、0.08 U·μL^-1 Taq DNA聚合酶以及1×PCR buffer;扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,退火1 min（根据不同引物选择不同的退火温度）,72℃延伸1 min,循环40次;72℃延伸10 min;12℃终止反应。该ISSR-PCR体系的建立,为今后利用ISSR技术对无距虾脊兰及其近缘种的分子系统学以及遗传多样性的研究奠定基础。     

中国木犀科苦丁茶ISSR实验条件优化的研究

系统地研究了中国木犀科苦丁茶ISSR反应体系中的主要影响因子,建立了一套稳定的ISSR PCR反应参数。筛选出了10个有效引物,并以中国木犀科苦丁茶8个物种共21份种质材料为供试材料对优化后的反应条件的重复性、多态性进行了检测。优化后的反应体系为：10×buffer 2.5 μL,2.0~3.0 mmol·L^-1 MgCl₂,150~300 μmol·L^-1 dNTPs,Taq酶1.0~1.5 U,引物0.4~0.5 μmol·L^-1,DNA模板5~320 ng。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min,然后按94℃变性40 s,50~54℃退火45 s,72℃延伸120 s,进行35个循环,最后72℃延伸8 min。该反应条件可应用于中国木犀科苦丁茶亲缘关系和遗传多样性分析。     

乌塌菜ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为获得乌塌菜ISSR-PCR的最佳反应体系,采用单因素浓度梯度试验和正交优化设计相结合的方法,研究了引物浓度、dNTP浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶用量对PCR反应的影响。并在此基础上对退火温度和循环数进一步优化,最终确立了适合乌塌菜ISSR PCR反应的最佳体系和程序。即20 μL PCR反应体系含：30 ng模板DNA,0.50 μmol·L^-1引物,0.25 mmol·L^-1 dNTP,1 mmol·L^-1 Mg²⁺,1.0 U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术对乌塌菜进行种质资源的分类鉴定奠定了基础。