无距虾脊兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化 |
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引用本文: | 钱鑫;连静静;刘芬;牛晓玲;王彩霞;田.无距虾脊兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].植物研究,2013,33(6):746-751. |
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作者姓名: | 钱鑫;连静静;刘芬;牛晓玲;王彩霞;田 |
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作者单位: | 1.中国林业科学研究院亚热带林业研究所,富阳 311400;;2.中国科学院华南植物园,广州 510650;;3.天目山国家自然保护区管理局,临安 311311 |
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摘 要: | 利用正交实验设计的方法,对珍稀植物无距虾脊兰ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶)4个水平进行试验,并通过梯度PCR实验确定引物的最佳退火温度和循环次数,最终确定无距虾脊兰的最佳反应体系为:25 μL的体系中含3.0 mmol·L-1 Mg2+、0.3 mmol·L-1dNTP、0.4 μmol·L-1引物、2.5 ng·μL-1模板DNA、0.08 U·μL-1 Taq DNA聚合酶以及1×PCR buffer;扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,退火1 min(根据不同引物选择不同的退火温度),72℃延伸1 min,循环40次;72℃延伸10 min;12℃终止反应。该ISSR-PCR体系的建立,为今后利用ISSR技术对无距虾脊兰及其近缘种的分子系统学以及遗传多样性的研究奠定基础。
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关 键 词: | 无距虾脊兰 ISSR 正交设计 |
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Calanthe tsoongiana |
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Institution: | 1.Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Fuyan 311400;2.South China Botanical Garden,Chinese Academy of science,Guangzhou 510650;3.Administration Bureau of Tianmu Mount National Nature Reserve,Lin’an 311311 |
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Abstract: | Orthogonal design was used to optimize ISSR-PCR amplification system of Calanthe tsoongiana in five factors (Mg2+, dNTP, primer, DNA template and Taq DNA polymerase) at four levels, respectively. The results showed that the suitable ISSR-PCR system was performed in a 25 μL volume containing 3.0 mmol·L-1 Mg2+, 0.3 mmol·L-1 dNTP, 0.4 μmol·L-1 primer, 2.5 ng·μL-1 DNA template, 0.08 U·μL-1 Taq DNA polymerase and 1×PCR buffer. The optimized augmentation procedure was pre denaturation at 94℃ for 5 min, followed by 40 cycles of 94℃ for 1 min, annealing at suitable temperature for different primers for 1 min, 72℃ for 1 min, extension at 72℃ for 10 min, and preservation at 12℃. This optimized ISSR-PCR system would play an important role in further research of molecular systematics and genetic diversity in C.tsoongiana. |
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Keywords: | Calanthe tsoongiana ISSR orthogonal design |
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