定点突变对酰胺水解酶DamH可溶性表达和酶活的影响

摘要:【目的】DamH是一种具有酯酶活性的酰胺水解酶,其非活性中心氨基酸残基的突变对重组酶可溶性表达和比酶活产生一定的影响。拟探索DamH的活性中心氨基酸残基构成,并对其非活性中心氨基酸残基突变对可溶性表达和比酶活的影响进行研究。【方法】通过重叠延伸的方法对DamH可能的活性中心氨基酸S149、E244和H274以及非活性中心氨基酸D165及N192进行定点突变,通过静息细胞测活验证了S149、E244和H274 在催化2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)水解反应中的作用,通过Ni2+- NTA亲和层析对D165及N192突变子进行纯化,对突变株和野生型比酶活进行比较。【结果】研究表明S149A使DamH的CMEPA 水解酶活性下降为野生型的5%,E244A和H274A突变导致其失去活性;D165P和N192P突变影响到DamH的可溶性表达,表达量分别为野生型的28.2%和20.8%,突变子N192P、D165P比酶活分别为野生型比酶活的55.5%和49.7%。【结论】DamH催化酯类底物和芳基酰胺类底物可能共用同一活性中心S149、E244和H274,其两个α螺旋的转角处氨基酸侧链极性和刚性结构的改变对可溶性表达以及活性有很大的影响。     

定点突变提高N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活和温度稳定性

【目的】提高N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA)酶活及温度稳定性。【方法】本研究基于AiiA同源蛋白的三维结构对AiiA进行定点突变,分析野生型AiiA及其突变蛋白酶活和温度稳定性。【结果】野生型AiiA较不稳定,在45℃下温浴30 min,或4℃储存5 d后均失去降解N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)的活性。但是突变AiiA蛋白(N65K,T195R和A206E)的酶活力较野生型AiiA均提高了20%以上,且4℃储存时间延长到7 d。此外,突变株N65K比野生型AiiA对高温具有更强的耐受性,在45℃温浴后剩余酶活力达到45%以上,55℃温浴30 min后仍保留5.0%的酶活力。【结论】通过定点突变改造AiiA蛋白结构,提升了AiiA蛋白的酶活和温度稳定性。     

通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc

利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变,在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cad A和ldc。查询NCBI数据库得知,二者的同源性为75%。分别构建重组质粒p Trc99a-cad A和p Trc99a-ldc,以此2种质粒为模板,经PCR扩增,获得目的基因片段,分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点,用多种限制性内切酶碎片化2种基因,切割成不同大小的片段。这些小片段进行不同组合,突变体经过LBXL平板初筛和高效液相色谱(HPLC)复筛,获得1株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体,编号为LDC2-16,其比酶活为4 869.86 U/mg(以1 mg总蛋白计),与2种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶Cad A(1 652.63 U/mg)、Ldc(2 365.93 U/mg)相比,在最适温度37℃、p H 6.0时,突变体的比酶活分别是上述野生型酶的2.95和2.06倍。摇瓶发酵5 h后,目标产物1,5-戊二胺产量从46.9提高至63.9 g/L,提高了36%。     

应用拉氏图信息提高短乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化性能

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是用于催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)的唯一酶,提高GAD的催化活力或热稳定性,有利于GABA的高效制备和生产。以热稳定性和活性为筛选目标,通过研究短乳杆菌GAD1407三维模拟结构的拉氏图,确定不稳定氨基酸残基位点K413,采用定点突变的方法构建该位点的突变体,并测定野生型酶和突变酶的热稳定性和活力。结果表明突变酶K413A和突变酶K413I分别在热稳定性和酶活力上获得了提高,突变酶K413A在50℃的半衰期为105 min,是野生酶的2.1倍;突变酶K413I热稳定性没有明显的提高,但其酶活力却得到了有效提高,约为野生型的1.6倍。因此,通过拉氏图提供的结构信息可为利用理性设计提高GAD活性和热稳定性提供指导。     

Myxococcus sp.V11海藻糖合酶TreS Ⅱ分子改造

来源于黏细菌Myxococcus sp. V11的海藻糖合酶(trehalose synthase,EC 2. 4. 1. 245) TreS Ⅱ可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力,但TreS Ⅱ对热敏感,在60℃保温3h,酶活性丧失,限制了其应用范围。目的:拟探索TreS Ⅱ影响热稳定性的氨基酸残基构成,通过对可能的氨基酸位点进行定点突变,以期获得耐热性的突变子,扩大TreS Ⅱ应用范围。方法:通过PCR介导的方法对TreS Ⅱ可能影响到热稳定性的氨基酸Q3、A283、W374、R449和Y537进行定点突变,以野生型重组酶为对照,比较突变型与野生型的最适反应温度和最适反应pH,通过测定不同温度下保存不同时间后的残留酶活,检测突变子的耐热效果。结果:研究表明突变子Q3D、A283R、W374D、R449Q和Y537H的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH和最适反应温度也未发生改变; A283R、Y537H在60℃条件下,3h后活性剩余68%; Q3D、W374D、R449Q在温度60℃时,3h后活性剩余35%。结论:TreS Ⅱ分子结构中与金属离子结合的几个氨基酸残基的改变对蛋白质分子的耐热性具有显著影响。     

催化吲哚生成靛蓝的细胞色素P450BM-3 定向进化研究

以催化吲哚产生的靛蓝在 630 nm 处具有特殊的吸收峰为高通量筛选指标,将来源于 Bacillus megaterium 的细胞色素 P450BM-3 单加氧酶的基因序列用易错聚合酶链式反应进行定向进化,通过多轮突变,在原有的能产靛蓝的高活力突变酶的基础上成功获得了三个高于亲本酶的突变酶,突变酶的酶活分别是亲本酶的 6.6 倍 (hml001) , 9.6 倍 (hml002) 和 5.3 倍 (hml003) ,并对突变酶的动力学参数进行了分析 . 突变酶 DNA 测序的结果表明, hml001 含有一个有义氨基酸置换 I39V , hml002 含有三个有义氨基酸置换 D168N , A225V , K440N , hml003 含有一个有义氨基酸置换 E435D ,这些突变位点有些远离底物结合部位,有些位于底物结合部位 .     

长双歧杆菌N-乙酰氨基己糖1-位激酶的活性位点

【目的】研究长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(Nacetylhexosamine 1-kinase,Nah K)中对催化活性有影响的位点。【方法】利用点突变试剂盒,获得Nah K的4个位点的共10种单点突变体表达菌株。诱导表达并纯化野生型和突变体酶,用DNS法和NADH偶联的微孔板分光光度法检测野生型及突变体酶的最适p H和最适Mg~(2+)浓度,并测定酶促反应动力学参数。【结果】D208A、D208N、D208E和I24A四种突变体的催化活性几乎丧失。突变体H31A、H31V、F247A和I24V的最适p H由野生型的7.5变为7.0,突变体H31A和F247A的最适Mg~(2+)浓度由野生型的5 mmol/L变为10 mmol/L。反应动力学参数测定结果表明,突变体F247Y对底物Glc NAc/Gal NAc及ATP的催化活性均高于野生型。【结论】通过定点突变,确定了对Nah K催化活性有影响的4个位点,并且获得了一个催化效率提高的突变体(F247Y),为进一步对Nah K进行分子改造奠定了一定基础。     

基于磷脂酶水解圈定向筛选高效聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶

【目的】目前自然环境中聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)废弃物的积累严重威胁生态健康,因此PET的降解问题已成为全球性的热点问题。生物酶法降解PET技术以其绿色环保而备受关注,但天然PET降解酶的催化活性普遍偏低,亟待进一步定向改造。现阶段定向进化为快速提高PET降解酶催化性能提供了可能,其中筛选方法是成功获得高性能突变体的关键所在。本研究旨在提出一种新型高效灵敏的筛选方法并应用于褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)来源角质酶Tfu-0883的定向改造,以期快速获得PET降解活性提高的突变体。【方法】基于易错PCR构建突变体文库,涂布于卵黄磷脂平板,以水解圈的大小作为筛选指标获得PET降解活性提高的突变体;对突变体进行酶学定性并筛选出潜在的分子改造位点,最终获得高性能突变体。【结果】从卵黄磷脂平板中挑取水解圈直径最大的单菌落,即突变体H10(N2D/D94H/A149E),其PET降解能力是野生型的1.5倍,最适温度与pH分别为60℃和8.0。突变体H10中第2位和第149位氨基酸残基远离底物结合凹槽,其突变会导致酶蛋白稳定性下降;第94位氨基酸残基则位于底物结合凹槽附近,由负电荷氨基酸Asp突变为正电荷氨基酸His,有利于吸附在带负电荷的PET表面,是突变体H10降解能力提升的关键因素;随后将野生型的第94位氨基酸残基Asp分别突变为His及同为正电荷且空间位阻更小的Lys和Arg,突变体D94H、D94K和D94R对PET降解能力均有提升,其中,突变体D94K降解PET能力是野生型的3.6倍。【结论】本研究基于磷脂酶水解圈构建了一种新的PET降解酶定向筛选方法,以此获得了降解活性提高的突变体,并证实角质酶Tfu-0883第94位氨基酸残基位点具有提升其PET降解活性的潜在能力。     

亚位点+1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性

通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变,得到3个优势突变体L194N(亮氨酸→天冬酰胺),A230D(丙氨酸→天冬氨酸),H233E(组氨酸→谷氨酸),然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变,获得7个复合突变体。研究结果表明,突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高,达到1.95 g/L,比野生型CGT酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析,发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析,突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。     

定点突变Ca~(2+)平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响

为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca~(2+)对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca~(2+)的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T_(1/2)值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca~(2+)对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。     

嗜热革节孢GH1 BGL1进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性的影响

糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1 BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335和E437这12个氨基酸残基进行定点突变,将突变酶与野生酶(WT)在毕赤酵母中表达,表达产物纯化后进行酶活性和葡萄糖耐受性测定。与WT相比,所有突变酶活性均有所降低,其中W168H、N335F和W349G几乎丧失活性。突变F180H、D237S、A260N和H307Y的Km低于WT,所有突变的kcat都降低。除L173Q外,其余突变都保持葡萄糖耐受性,在高浓度(400 mmol/L)葡萄糖时,Y179F和D237S酶活受到显著抑制。本研究表明,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性均具有一定影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。     

定向进化提高嗜热拟青霉J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酸性条件下的催化能力

应用定向进化技术提高了嗜热拟青霉Paecilomyces thermophila J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶(PtLic16A)在酸性条件下的催化能力.结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了β-葡聚糖酶的突变体文库;利用刚果红染色法建立了阳性克隆的高通量筛选体系.筛选得到的突变酶PtLic 16AM1的反应最适pH由7.0变化至5.5,且保持了原有的耐热性和比酶活.突变酶的DNA序列中有4个点位发生突变,引发了4处氨基酸替换,分别是T58S、Y110N、G195E和D221G.结构模拟结果显示,发生突变的4个氨基酸位点中,Y110N位置靠近酶活性中心,而T58S、G195E和D221G则离酶活性中心较远,其中T58S、G195E可能对酶最适pH的变化起到了关键作用.     

Myxococcus sp.V11海藻糖合酶TreS II分子改造 *

来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase, EC 2.4.1.245)TreS II可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力,但TreS II对热敏感,在60℃保温3h,酶活性丧失,限制了其应用范围.目的:拟探索TreS II影响热稳定性的氨基酸残基构成,通过对可能的氨基酸位点进行定点突变,以期获得耐热性的突变子,扩大TreS II应用范围.方法: 通过PCR介导的方法对TreS II可能影响到热稳定性的氨基酸Q3,A283,W374,R449和Y537进行定点突变,以野生型重组酶为对照,比较突变型与野生型的最适反应温度和最适反应pH,通过测定不同温度下保存不同时间后的残留酶活,检测突变子的耐热效果.结果: 研究表明突变子Q3D,A283R,W374D,R449Q和Y537H的比酶活与野生型无显著差异,且最适pH 和最适反应温度也未发生改变;A283R,Y537H在60℃条件下,3h后活性剩余68%;Q3D,W374D,R449Q在温度60℃时,3h后活性剩余35%.结论: TreS II分子结构中与金属离子结合的几个氨基酸残基的改变对蛋白质分子的耐热性具有显著影响.     

E92A是HIV-1整合酶耐药突变N155S的活性回复突变

HIV-1整合酶是目前抗艾滋病药物研发的重要靶点之一,整合酶的耐药突变是导致整合酶抑制剂类药物治疗失败的主要原因,但突变产生耐药性的机理仍不清楚.本工作通过人工构建突变型整合酶,测试其活性和耐药性,对整合酶的耐药机理进行初步探索.构建整合酶的突变型包括E92A、N155S两种单突变及E92A/N155S双突变.通过基因工程操作引入突变、构建质粒、表达纯化得到整合酶蛋白.用基于磁珠的整合酶链转移ELISA测试整合酶的链转移活性,用S-1360和Raltegravir两种抑制剂测试整合酶的耐药性.另外,用Autodock软件做了S-1360和整合酶核心区(包括野生型和突变型)的分子对接.结果表明,N155S突变使整合酶链转移活性下降约80%,而E92A/N155S双突变仅使活性下降约42%,这表明N155S突变基础上的E92A突变可使整合酶的活性大幅回复.E92A和E92A/N155S对不同的抑制剂可产生不同的耐药性,它们对Raltegravir的耐药性强于对S-1360.突变对整合酶活性和耐药性的影响主要是通过改变整合酶活性中心结构实现的,E92A突变可能导致其与周围残基静电相互作用减弱,间接影响到D64和D116残基,产生活性回复作用.     

嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究

对来源于嗜热古菌Aeropyrum pernix的酯酶(APE1547)催化活性进行定向进化研究。利用APE1547特殊的稳定性,建立了准确的高通量高温酯酶筛选方法。对第一代随机突变库筛选获得了催化活性较野生型提高1.5倍的突变体M010,序列分析表明其氨基酸突变为R526S。从第二代突变库中筛选出的总活力提高5.8倍突变体M020,突变位点为R526S/E88G/A200T/I519L,其比活力与M010一致,但表达量比野生型提高约4倍。对M020酶学性质表征发现,其最适pH为8.5,比野生型向碱性偏移0.5;活性中心残基酸性基团的解离常数(pK1)由野生型的7.0提高至7.5。晶体结构分析表明,突变位点R526距离活性中心较近,将其突变为Ser降低了活性中心的极性,抑制了催化残基His的解离,使酸性基团的解离常数升高。     

金属离子对重组深渊滕黄单胞菌低温α-淀粉酶LamA的活性和稳定性影响

【背景】深渊藤黄单胞菌XH031 (Luteimonas abyssi XH031)是从深海分离到的一株具有很强淀粉降解能力的细菌,前期实验显示其α-淀粉酶LamA在低温环境下仍能保持较高酶活力。若能够提升其热稳定性,会有更好的应用前景。【目的】分析钙离子的存在对LamA热稳定性的影响,并通过钙离子结合位点的关键氨基酸的定点突变,初步明确其作用机制。【方法】在不同的离子条件下检测LamA的热稳定性,利用生物信息学方法预测可能影响钙离子结合及耐热性的氨基酸位点,对目的氨基酸进行定点突变,表达和纯化突变蛋白,并进行功能鉴定。【结果】钙离子明显提高了LamA的热稳定性:在未添加钙离子时,于65°C处理30 min已完全失活;而在5 mmol/L钙离子条件下,于65°C处理30 min后仍具有36%的酶活力。对预测位点进行定点突变后,突变蛋白D200R和H233D/M234C完全失活;N120D、Q185E和T224D活性降低。在未添加钙离子时,突变蛋白稳定性受高温影响程度与野生型差别不大;而在钙离子条件下,N120D在65°C时的酶活力仅为野生型的27.8%,推测位点Asn120与钙离子的结合能够稳定低温酶LamA在较高温度下的结构。【结论】初步明确了钙离子可提升低温α-淀粉酶LamA的热稳定性,为今后相关酶类的工程改造提供理论基础。     

利用定点突变法研究精氨酸脱亚胺酶活性的影响机制

精氨酸脱亚胺酶(ADI)是一种针对精氨酸缺陷型癌症(如:肝癌、黑素瘤)的新药,目前处于临床三期试验。文中通过定点突变技术分析了精氨酸脱亚胺酶的特定氨基酸位点对酶活力的影响机制。针对已报道的关键氨基酸残基A128、H404、I410,采用QuikChange法进行定点突变,获得ADI突变株M1(A128T)、M2(H404R)、M3(I410L)和M4(A128T/H404R)。将突变株在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,并对纯化获得的突变蛋白进行酶学性质研究。结果表明,突变位点A128T和H404R对ADI最适pH的提高,生理中性(pH 7.4)条件下的酶活力和稳定性的提高,以及Km值的降低均具有显著的作用。研究结果为阐明ADI的酶活力影响机制和蛋白质的理性改造提供了一定的依据。     

N13D、S40E点突变提高木聚糖酶XYNB的热稳定性

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性比XYNB分别提高了24.76%和14.46%;突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22%。在其他性质方面突变酶N13D、S40E与野生型酶XYNB基本相似。通过对木聚糖酶XYNB的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。     

基于体外分子进化技术提高弯曲芽孢杆菌CCTCC 2015368 β-淀粉酶的热稳定性

运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC2015368β-淀粉酶突变体。利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显著提高的突变体D476N。野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5。突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95%。突变体D476N的T_(50)值比野生型提高4℃。突变体D476N的K_m值为97.98μmol/L,是野生型(85.86μmol/L)1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降。通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的三维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(ΔG)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3%,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符。     

短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶脱氢催化机理

【目的】为研究短链壬基酚聚氧乙烯醚脱氢酶(sNPEO-DH)的脱氢氧化机制(基因克隆于Ensifer sp.AS08),我们进行了以下实验。【方法】采用同源序列比对及同源建模的方法筛选出与其辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)异咯嗪基邻近的4个氨基酸残基。以定点突变方法分别构建了突变体,并进行了重组蛋白的表达纯化和酶活力测定。【结果】野生型和突变体的酶学动力学实验表明,突变体N90A和N509A对亲水性底物聚乙二醇(PEG1000)的相对活性分别降低为51%和89%,对疏水性底物sNPEO的活性分别降低为26%和40%,说明氨基酸残基N90和N509可能与底物的结合相关。突变体H465A的相对活性丧失了90%以上,突变体N507A完全丧失活性;瞬时"停-流"检测实验进一步证明N507A突变体阻断了底物向FAD传递质子的过程,突变体H465A阻断了对FAD还原形成的FADH2脱氢再生的过程。【结论】以上结果说明N507和H465为sNPEO脱氢酶活性中心中参与对底物氧化脱氢及FADH2脱氢再生进行下一次反应的催化位点。