N-酰基高丝氨酸内酯酶的分子改造及酶学特性

革兰氏阴性细菌的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactone, AHL）作为主要信号分子诱导致病因子表达,造成细菌性病害. N-酰基高丝氨酸内酯酶（N-acyl-homoserine lactonase, AHLase）能水解AHL分子的内酯键,减弱致病菌的危害.本研究利用从苏云金芽孢杆菌克隆的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因（auto inducer inactivation A, aiiA）,根据Swiss-model模拟aiiA所编码的AiiA蛋白三维结构,预测可能形成的分子内盐桥、活性中心位点等,利用环状诱变方法对AiiA进行定点突变,以期提高其酶活力和热稳定性等酶学性能.对AiiA及其突变蛋白酶学特性分析结果发现,突变体AiiA-N65K-A206E酶活力要比野生型AiiA-wild提高87.4%,并表现出良好的热稳定性和储存稳定性;37 ℃温浴30 min后酶活力剩余73;9%,比AiiA-wild有了大幅提高;4 ℃储存120 h后酶活力剩余12.9%,而AiiA-wild丧失酶活力.酶动力学分析表明,AiiA-N65K-A206E酶促反应的米氏常数Km为1.23 mmol/L,与野生型相当;最大反应速率Vmax为32.36 μmol/L/min,比野生型有较大提高.本研究表明,利用定点突变技术改造AiiA的分子结构,可有效提升AiiA酶活力、热稳定性和储存稳定性.本研究结果为进一步阐明AiiA结构与功能的关系,促进AiiA在植物病害生物防治上的应用,提供了有益的参考和新的思路.     

N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA的分子改造及酶学特性

革兰氏阴性细菌的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)作为主要信号分子诱导致病因子表达,造成细菌性病害.N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AHLase)能水解AHL分子的内酯键,减弱致病菌的危害.本研究利用从苏云金芽孢杆菌克隆的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(auto inducer inactivation A,aiiA),根据Swiss-model模拟aiiA所编码的AiiA蛋白三维结构,预测可能形成的分子内盐桥、活性中心位点等,利用环状诱变方法对AiiA进行定点突变,以期提高其酶活力和热稳定性等酶学性能.对AiiA及其突变蛋白酶学特性分析结果发现,突变体AiiA-N65K-A206E酶活力要比野生型AiiA-wild提高87.4%,并表现出良好的热稳定性和储存稳定性;37℃温浴30 min后酶活力剩余73.9%,比AiiA-wild有了大幅提高;4℃储存120 h后酶活力剩余12.9%,而AiiA-wild丧失酶活力.酶动力学分析表明,AiiA-N65KA206E酶促反应的米氏常数Km为1.23 mmol/L,与野生型相当;最大反应速率Vmax为32.36μmol/L/min,比野生型有较大提高.本研究表明,利用定点突变技术改造AiiA的分子结构,可有效提升AiiA酶活力、热稳定性和储存稳定性.本研究结果为进一步阐明AiiA结构与功能的关系,促进AiiA在植物病害生物防治上的应用,提供了有益的参考和新的思路.     

枯草芽孢杆菌SS6N-酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆表达及其酶学特性

摘要:【目的】从一株具有细菌群体感应(Quorum Sensing,QS)信号分子淬灭活性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) SS6中扩增N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA)基因aiiASS6并异源表达,研究此信号降解酶的酶学特性。【方法】设计特异性引物,从B.subtilis SS6中克隆N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiASS6,测序并进行生物信息学分析;将此基因克隆到表达载体pET28(a),构建重组菌株并提纯目的蛋白AiiASS6;然后用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分析目的蛋白AiiASS6降解QS信号分子N-(3-Oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (OOHL)的酶学特性。【结果】克隆得到基因片段,命名为 aiiASS6 (GenBank: KP125494),其编码一条含有297氨基酸残基的多肽,用pET28(a)成功构建重组质粒pET28-aiiASS6。生物信息学分析表明,AiiASS6的氨基酸序列含有N-酰基高丝氨酸内酯酶典型的“HXHXDH”基序和194 位的Tyr残基。在Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达AiiASS6,用Ni柱纯化后,AiiASS6含量达2.76 mg/mL。HPLC检测结果表明AiiASS6对OOHL具有很强的催化活性及耐热性,Km和Vmax分别为0.998 mmol/L和22.3 U/mg,最适pH为7.6,最适温度范围为50－90℃;此酶在4℃保存3个月后其残余活性仍达到86%,表现出较强的稳定性。【结论】从B．subtilis SS6中获得的QS淬灭酶AiiASS6表现出降解QS信号分子的高活性,其酶学特性表明它具有作为微生物制剂防控植物或水产养殖中基于QS调控的病原菌毒力的应用潜力。     

密码子优化提高aiiaB546毕赤酵母表达活性

N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子(AHLs)的蛋白水解酶,通过水解AHLs生成酰基高丝氨酸,使AHLs失去活性,从而阻断病原菌的群体感应路径,使病原菌失去致病能力,其广泛存在于多种微生物中[1,2]。近年来N-酰基高丝氨酸内酯酶作为一种新型抗菌策略(群体感应淬灭策略)的工具酶而成为水产养殖防治细菌性疾病研究的热点[3—5]。     

红球菌来源QsdA型N-酰基高丝氨酸内酯酶水产养殖饲用潜力分析

通过研究QsdA型N-酰基高丝氨酸内酯酶酶学性质来评估其饲用潜力。研究通过提取红球菌(Rhodococcus erythropolis)BLJF-1的基因组, 利用 PCR 技术克隆得到N-酰基高丝氨酸内酯酶基因qsdA-rh5。构建重组表达载体pET28a/qsdA-rh5转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选得到具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的转化子即为重组菌株, 随后经Ni-NTA柱纯化得到的重组蛋白QsdA-RH5进行补充酶学性质的研究。结果表明, 克隆得到972 bp的目的基因。构建重组载体, 筛选得到重组菌株经诱导表达后得到具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的目的蛋白即QsdA-RH5, 经分析表明, 该蛋白的理论分子量为36 kD, 属于金属依赖性水解酶PET超家族。酶学性质研究表明: 其最适作用 pH 为 8.0, 作用温度为 35℃, 在 pH 611内能够稳定的存在, 在1040℃, 酶活性能够维持在 80% 以上, 且该酶对多种金属离子、化合物具有很好的抗性。该融合蛋白具有较为专一的底物特异性, 只对没有取代基团的底物具有水解作用, 以C7-HSL 为底物时的Km值为0. 0125 mmol/L。实验经酶学性质研究表明, 该酶具有较为专一的底物特异性, 因此可具有针对性的控制外源性病原菌毒性效应对维护畜禽(水产)消化道健康方面具有一定的应用前景。       

凡纳滨对虾源不动杆菌群体感应信号分子分离鉴定及其调控

【目的】鉴定凡纳滨对虾源不动杆菌(Acinetobacter spp.M1)分泌的N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)类型,探究细菌生长阶段及环境因素对其分泌信号分子的影响。【方法】报告菌株平板法检测M1的AHLs的活性;采用报告平板与薄层层析(TLC)相结合法对M1分泌的AHLs类型进行鉴定。【结果】菌株M1分泌N-3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯和N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯两种信号分子。在适宜条件下AHLs活性随着培养时间的延长先升高后降低,在对数末期(30 h)达到最大。弱酸和弱碱环境能够降低M1分泌AHLs的能力,p H 7.0是M1分泌AHLs的最适p H。较高浓度的Na Cl促进了个体M1分泌AHLs的能力,但是Na Cl浓度对M1总体分泌AHLs没有显著的影响。菌株M1分泌AHLs的最佳温度为30°C,温度过高或过低都会影响其分泌。【结论】菌株M1主要产生N-3-氧代-己酰基-高丝氨酸内酯和N-3-氧代-辛酰基-高丝氨酸内酯两种类型信号分子。M1的QS系统受菌体密度和环境因素的双重调控。     

高效表达N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其酶学性质

摘要: 【目的】构建N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶双酶活性表达毕氏酵母重组菌株,并对经纯化的重组蛋白SL2B 进行N-乙酰高丝氨酸内酯酶及木聚糖酶酶学性质的研究。【方法】利用PCR 拼接技术得到N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因aiiA-B546 和木聚糖酶基因xynAS27cd 融合而成的基因Sl2b。构建重组表达载体pPIC9 / Sl2b 转化毕氏酵母,筛选得到同时具有木聚糖酶和N-乙酰高丝氨酸内酯酶活性的重组子,随后对经硫酸铵沉淀、分子筛纯化后得到的重组蛋白SL2B 进行N-乙酰高丝氨酸内酯酶及木聚糖酶     

土壤中群体感应淬灭细菌的原位分离与筛选

【背景】许多革兰氏阴性细菌通常以N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs)作为群体感应主要的信号分子。【目的】从土壤中筛选和鉴定新型群体感应淬灭细菌。【方法】通过"垫圈法"从土壤中原位培养分离细菌,采用琼脂条法、报告菌平板法及β-半乳糖苷酶活性测定筛选群体感应淬灭细菌,根据16S rRNA基因序列同源性分析确定菌株系统发育地位。【结果】从不同地区土样中原位培养共分离获得细菌502株。以根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4)作为报告菌,最终得到11株具有较强降解AHLs能力的细菌,包括假单胞菌5株、不动杆菌4株、变形杆菌和莱茵海默氏菌各1株。大部分细菌可完全降解N-3-羰基十二酰基高丝氨酸内酯(3OC12-HSL),部分细菌对N-(3-氧代己酰)高丝氨酸内酯(3OC6-HSL)和N-3-氧代辛酰高丝氨酸内酯(3OC8-HSL)具有一定降解活性。【结论】Proteus和Rheinheimera可降解AHLs,为今后防治依赖群体感应的植物细菌病害提供新型生防资源。     

芽孢杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及表达

N-酰基高丝氨酸内酯(N—acyl—homoserine hctones．AHLs)作为细菌群体应答系统(Quorum—sensing)中的关键信号分子,其浓度是决定许多动、植物病原菌致病基因的表达的关键因子,酰基高丝氨酸内酯酶基因可以水解AHk丹子的内酯键,使．MILs失去生物活性,从而减弱致病菌的危害．该研究旨在从芽孢杆菌中克隆酰基高丝氨酸内酯酶基因并获得纯化蛋白。根据已知酰基高丝氨酸内酯酶基因的保守序列设计引物,利用PCR方法从2株芽孢杆菌的基因组DNA中克隆出阿个基因SS1和SS10。利用在基因库中进行同源比对．结果表明SS1和SS10编码的蛋白产物SS1和SS10均为酰基高丝氨酸内酯酶。将两个基因在大肠杆菌中诱导表达,通过亲和层析获得了纯化蛋白。     

金属离子对重组深渊滕黄单胞菌低温α-淀粉酶LamA的活性和稳定性影响

【背景】深渊藤黄单胞菌XH031 (Luteimonas abyssi XH031)是从深海分离到的一株具有很强淀粉降解能力的细菌,前期实验显示其α-淀粉酶LamA在低温环境下仍能保持较高酶活力。若能够提升其热稳定性,会有更好的应用前景。【目的】分析钙离子的存在对LamA热稳定性的影响,并通过钙离子结合位点的关键氨基酸的定点突变,初步明确其作用机制。【方法】在不同的离子条件下检测LamA的热稳定性,利用生物信息学方法预测可能影响钙离子结合及耐热性的氨基酸位点,对目的氨基酸进行定点突变,表达和纯化突变蛋白,并进行功能鉴定。【结果】钙离子明显提高了LamA的热稳定性:在未添加钙离子时,于65°C处理30 min已完全失活;而在5 mmol/L钙离子条件下,于65°C处理30 min后仍具有36%的酶活力。对预测位点进行定点突变后,突变蛋白D200R和H233D/M234C完全失活;N120D、Q185E和T224D活性降低。在未添加钙离子时,突变蛋白稳定性受高温影响程度与野生型差别不大;而在钙离子条件下,N120D在65°C时的酶活力仅为野生型的27.8%,推测位点Asn120与钙离子的结合能够稳定低温酶LamA在较高温度下的结构。【结论】初步明确了钙离子可提升低温α-淀粉酶LamA的热稳定性,为今后相关酶类的工程改造提供理论基础。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.