重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

听神经元的频率调谐

频率作为声音的一个重要参数,在听敏感神经元对声音进行分析和编码过程中扮演重要角色。一般用频率调谐曲线来表示听敏感神经元的频率调谐特性,并用Qn(10,30,50)值表达频率调谐曲线的尖锐程度,Qn值越大,频率调谐曲线也越尖锐,神经元的频率调谐能力越好,对频率的分辨能力越高。从听觉外周到中枢,听敏感神经元的频率调谐逐级锐化,而这种锐化主要是由听中枢的多种抑制性神经递质的作用而产生的,其中起主要作用的是GABA能和甘氨酸能神经递质。此外,离皮层调控,双侧下丘间的联合投射以及弱噪声前掩蔽等因素也会影响听敏感神经元的频率调谐特性。     

纳布啡鞘内注射对糖尿病神经痛模型大鼠行为能力及背根神经节TRPV1表达的影响

摘要 目的：探讨纳布啡鞘内注射对糖尿病神经痛（diabetic neuropathic pain, DNP）模型大鼠行为能力及背根神经节瞬时受体电位V1（transient receptor potential V1,TRPV1）表达的影响。方法：将糖尿病神经痛模型大鼠（n=48）随机平方为三组-模型组、纳布啡1组与纳布啡2组,每组16只。纳布啡1组与纳布啡2组分别给予纳布啡鞘内注射0.5 μg/10 μL与1.0 μg/10 μL,模型组给予注射等剂量的0.9 %氯化钠溶液,每天1次。分别于治疗第7 d、第14 d,采用血糖仪测定与记录空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）水平并进行机械痛阈检测;治疗第14 d、第28 d,采用酶联免疫法检测血清IL-6与TNF-α含量,采用免疫印迹法检测背根神经节TRPV1蛋白的相对表达。结果：模型组、纳布啡1组与纳布啡2组治疗第7 d、第14 d的空腹血糖水平都高于20.00 mmol/L,组内与组间对比差异不具有统计学意义（P>0.05）。纳布啡1组与纳布啡2组治疗第7 d、第14 d的机械痛阈高于模型组（P<0.05）,也高于治疗前（P<0.05）,纳布啡2组与纳布啡1组差异具有统计学意义（P<0.05）。纳布啡1组与纳布啡2组治疗第14 d、第28 d的血清白细胞介素（Interleukin,IL）-6与肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α含量明显低于模型组（P<0.05）,纳布啡2组明显低于纳布啡1组（P<0.05）。纳布啡1组与纳布啡2组治疗第14 d、第28 d的背根神经节TRPV1相对表达水平明显低于模型组（P<0.05）,纳布啡2组明显低于纳布啡1组（P<0.05）。结论：纳布啡鞘内注射在糖尿病神经痛模型大鼠的应用能改善行为能力,抑制背根神经节TRPV1的表达,还可抑制血清IL-6与TNF-α的释放,从而发挥镇痛治疗效用。     

环境雌激素生态影响的研究进展

环境雌激素(ｅｃｏｅｓｔｒｏｇｅｎ) ,是指能够扰乱动物内分泌活动 ,生理活性与雌激素较为相似的动物体外化学物质 ,包括人工合成化合物以及植物天然雌激素 ,由于目前所发现的干扰动物及人体内分泌系统的有机化合物绝大多数都具有激素特征 ,因此通常又将环境激素称做“干扰内分泌化合物”(ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ或ｅｎｄｏｃｒｉｎｅｄｉｓｒｕｐｔｅｒｓ)。环境激素问题只是在最近几年才引起世界关注 ,但由于环境激素污染范围广、影响大 ,对人类生存的威胁更直接 ,目前 ,西方国家将环境激素问题与臭…     

野生黄花苜蓿花药愈伤组织的诱导和植株再生

植物名称:野生黄花自蓿(Medicago falcata)。系由内蒙古照乌达盟采种,于呼和浩特市内蒙古自治区草原研究所播种的三年内苗。材料类别:花药。取花萼紧包花冠,花冠稍外露的花蕾。此时花粉处于单核靠边期,而且花药可整取。接种前花药在4℃低温下处理6～16小时。培养条件:基本培养基为MS,诱导愈伤组织阶段每升培养基加入2,4-D、KT、IAA、NAA、Ade、RNA各1～2mg,蔗糖3～6％,pH值5.8～6.0。     

放牧及土壤斑块质量对白三叶密度及分枝格局的影响

对白三叶长期禁牧草地及土壤斑块质量不同的春季休牧草地的研究结果显示,４月份,在中等放牧强度草地上,约有７６．５％￣８０．４％的白三叶植株为茎部出现断折的残株,放牧草地植株密度明显高于对照草地。放牧草地较好的土壤营养条件使白三叶单株构件数量明显上升,但使分枝强度略有下降。白三叶各构件密度之间存在显著正相关。不同样地上白三叶的分枝均以２、３级分枝为主。放牧草地的分枝角度大小顺序为：１级分枝角＞２级分枝     

缺血性脑血管病变组织中葡萄糖转运蛋白1的改变

葡萄糖通过血脑屏障从血液中进入脑组织必须依赖葡萄糖转运蛋白(glucose transporter,GLUT)的帮助.GLUT1是血脑屏障上最主要的GLUT,也是脑毛细血管壁内皮细胞的分子标记.动物研究显示在急性脑缺血后脑内的GLUT1表达增加.检测了7例慢性微血管缺血性脑血管病变(ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)的尸检脑组织中的GLUT1水平,并与11例同龄对照组比较.结果发现GLUT1水平在ICVD组中降低.其降低可能是由于低氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α)的下调所致.但是,在ICVD脑组织中的GLUT1水平降低不伴随有蛋白质O-GlcNAc糖基化水平的下降.上述结果为探讨脑缺血病变的机理提供了新线索.     

拉布拉多犬的母性行为水平对幼犬胆量的影响

母性行为是动物以维持幼崽的生存及生理健康为主要目的的一种基本行为,母性行为作为重要的早期经历对动物的个体发展有深远影响。动物的行为在时间和环境中具有一致性,多个行为特征的一致性加权被称为气质特征,气质特征的差异是犬(Canis lupus familiaris)能否顺利通过培训成为导盲犬的决定性因素。其中,胆量是决定导盲犬培训成功与否的重要气质特征。本研究以中国导盲犬大连培训基地的拉布拉多种犬及幼犬为研究对象,探究母性行为水平对幼犬胆量的影响。本研究通过视频观察记录拉布拉多犬哺乳期前21 d的母性行为变量时长,对在哺乳区内、身体接触、哺乳和舔舐幼犬4项变量进行主成分分析后将7只实验犬分为母性行为高水平与低水平两组。对两组犬生产的共54只幼犬于6 ~ 8周龄时进行幼犬胆量行为测试,根据胆量行为测试的评分标准对幼犬的行为表现进行评分,统计分析母性行为高水平组与低水平组其幼犬的胆量是否存在差异。本研究结果表明,母性行为低水平组的幼犬在胆量测试中面对陌生环境、突然出现的响声刺激、突然打开的雨伞刺激以及陌生人的游戏邀请时均表现出更大的胆量。在被动测试中,母性行为低水平组幼犬的探索潜伏时长显著短于母性行为高水平组幼犬(P < 0.05),探索范围显著大于母性行为高水平组幼犬(P < 0.05),紧张程度极显著低于母性行为高水平组幼犬(P < 0.01);在金属响声测试中,母性行为低水平组幼犬的惊吓反应(P < 0.01)和紧张程度(P < 0.01)均极显著低于母性行为高水平组幼犬;在雨伞测试中,母性行为低水平组幼犬的紧张程度显著低于母性行为高水平组幼犬(P < 0.05);在玩具测试中,母性行为低水平组幼犬的玩耍兴趣显著高于母性行为高水平组幼犬(P < 0.05),紧张程度显著低于母性行为高水平组幼犬(P < 0.05);在斜坡隧道测试中,母性行为低水平组幼犬的紧张程度显著低于母性行为高水平组幼犬(P < 0.05),通过斜坡的用时短于母性行为高水平组幼犬,但经统计检验无显著差异(P > 0.05)。本研究的结论为低母性行为水平带给幼犬强度适当的早期生活压力,使幼犬面对新环境刺激时表现出更好的适应能力和较大的胆量。本研究为工作犬种犬的筛选提出新的建议：母性行为水平低的种犬对幼犬胆量的发展有更好的影响。     

银杏聚戊烯醇柱层析纯化工艺的研究

对银杏聚戊烯醇柱层析纯化条件进行研究,所得产物经薄层层析与高效液相色谱分析,聚戊烯醇含量超过90％。     

实验用西藏小型猪CYP3A基因的克隆及序列分析

目的:克隆西藏小型猪CYP3A基因并与人及其它小型猪品种进行序列比对分析。方法:根据Genebank数据库设计引物,取西藏小型猪新鲜肝脏组织,Trizol法提取肝脏总RNA,应用RT-PCR反转获得肝脏cDNA。分别扩增基因CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39,PCR片段回收后分别连接pMD-18T载体,获得重组质粒pT-CYP3A,阳性重组克隆送测序。采用NCBI Blast及vector NTI软件进行序列比对分析。结果:CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39基因编码序列全长1512 bp,编码503个氨基酸,与人CYP3A4相同。其中CYP3A22和CYP3A39与NCBI记录巴马小型猪序列相同;CYP3A46与巴马小型猪CYP3A46(NM_001134824.1)有6个位点碱基不同。CYP3A29与巴马小型猪CYP3A46(EU918131.1)亦有6个位点碱基不同。对来自2个母本后代猪的基因经过PCR扩增后测序发现CYP3A46、CYP3A29序列完全一致。结论:成功克隆西藏小型猪CYP3A的4个基因,其中CYP3A46与人CYP3A4的序列相似性最高。所得CYP3A46与CYP3A29序列可能为西藏小型猪独有。