新vip3Aa基因的克隆、表达及其序列分析

克隆了Bt9816C的vip3A基因，并将测序结果提交到GenBank (序列号：AY945939)。该基因是一个新的vip3Aa基因, Bt杀虫晶体蛋白命名委员会将其命名为vip3Aa18。在大肠杆菌BL21中表达了该基因，生物测定结果表明纯化的Vip3Aa18蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性。序列分析结果显示Vip3Aa18 C端536至667位氨基酸残基间是一个糖类结合域，推测可能参与Vip3Aa18与敏感昆虫中肠受体结合；N端272至292位氨基酸残基间存在一个跨膜螺旋，可能与Vip3Aa18形成穿孔有关。此外，Vip3Aa18还可能具有一个二硫键。这些特殊区域和位点可能与其功能密切相关。     

新vip3Aa基因的克隆、表达及其序列分析

克隆了Bt9816C的vip3A基因,并将测序结果提交到GenBank(序列号:AY945939)。该基因是一个新的vip3Aa基因,Bt杀虫晶体蛋白命名委员会将其命名为vip3Aa18。在大肠杆菌BL21中表达了该基因,生物测定结果表明纯化的Vip3Aa18蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性。序列分析结果显示Vip3Aa18C端536至667位氨基酸残基间是一个糖类结合域,推测可能参与Vip3Aa18与敏感昆虫中肠受体结合;N端272至292位氨基酸残基间存在一个跨膜螺旋,可能与Vip3Aa18形成穿孔有关。此外,Vip3Aa18还可能具有一个二硫键。这些特殊区域和位点可能与其功能密切相关。     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bt菌株和41个Bt标准菌株中筛选到39株即约25%的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析,发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89 kD大小的蛋白,其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株,即S101和611,并分别进行vip3A基因的克隆和测序,再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较,结果表明,vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个vip3A基因即vip3AS101和vip3A611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-611,转化到大肠杆菌M15,经1 mmol/L IPTG诱导后均表达89 kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明,Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48%和35%的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-611蛋白和已报道的Vip3A-S184蛋白对初孵斜纹夜蛾 (Spodoptera litura) 幼虫进行生物测定,结果表明,3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异,这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用*

将构建的营养期杀虫蛋白基因vip83表达质粒pBMB2 32 8和含杀虫晶体蛋白基因(cry1Ac1 0或cry1Ca)质粒同时电转化无质粒突变株BMB1 71并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证 ,分别得到含cry1Ac1 0和vip83、cry1Ca和vip83的双基因重组菌BMB2 830 1 71和BMB2 882 1 71。用单基因重组菌作对照 ,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白Cry1Ac1 0和Cry1Ca两组蛋白对 3种重要鳞翅目害     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的鉴定、克隆及活性分析

【目的】鉴定我国自行分离的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）菌株中vip3A基因的分布和基因型,从其中对鳞翅目幼虫表现高毒力的Bt菌株中克隆vip3Aa基因。【方法】利用PCR-RFLP方法确定vip3A基因的分布和鉴定基因型,利用PCR方法克隆vip3A全长基因。【结果】171株野生型Bt菌株中共鉴定出63株含有vip3A基因,均与vip3Aa1类基因相似。从TF9和Bt16菌株中克隆得到2个vip3Aa基因,分别构建了携带vip3Aa基因的表达载体p30vip-26和p30vip-27,SDS-PAGE和Western Blot分析表明,IPTG诱导后均可表达88 kDa左右的Vip3A蛋白,蛋白可溶性分析表明约10%可溶。这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为vip3Aa26和vip3Aa27。生物测定结果显示,Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）3种重要鳞翅目害虫初孵幼虫的毒力较高,LC50值分别为0.125 μg/mL,0.238 μg/mL和9.238 μg/mL。而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾有活性,LC50值为4.423 μg/mL。【结论】本研究中的Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫均能表现高杀虫活性,而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾幼虫有活性,实验结果表明Vip3A蛋白个别氨基酸的变化对其杀虫活性影响很大。     

苏云金芽胞杆菌Vip3AaAdAa嵌合蛋白的构建及其杀虫活性分析

Vip3A类杀虫蛋白是一类新型杀虫蛋白,在氨基酸序列上与研究较为深入的Cry蛋白没有同源性,且昆虫受体结合位点与Cry蛋白也没有竞争关系。利用同源重组技术针对对甜菜夜蛾具有高活性的Vip3Aa39与无活性的Vip3Ad开展研究,成功构建了三个vip3AaAdAa型嵌合基因,将其转入大肠杆菌中表达嵌合蛋白Vip3AaAdAa1、Vip3AaAdAa2、Vip3AaAdAa3,并将这三种嵌合蛋白对甜菜夜蛾进行了杀虫活性测定。研究表明,三种嵌合蛋白对甜菜夜蛾具有杀虫活性,Vip3AaAdAa3蛋白的LC_(50)值比Vip3Aa39增加了1.4倍,Vip3AaAdAa1蛋白的LC_(50)值比Vip3Aa39增加了2.7倍,嵌合蛋白Vip3AaAdAa1和Vip3AaAdAa3的杀虫活性均低于Vip3Aa39;Vip3AaAdAa2的杀虫活性与Vip3Aa39差异不显著。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株S184中克隆了2.3 kb大小的vip3A基因并进行了序列分析。将vip3AS184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89 kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19%是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、斜纹夜蛾(S.litura)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3AS184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究

以我室自行分离的对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88为材料,用PCR-RFLP方法从其质粒DNA文库中筛选到含cry2Ab基因的一个阳性克隆pZF858,序列测定发现,该片段含有cry2Ab全长基因,开放读码框为1902bps,编码由633个氨基酸组成的70.7kD蛋白,氨基酸同源性与已公布的cry2Ab基因同源性均为99.8％,经Bt基因国际命名委员会正式命名为cry2Ab。根据cry2Ab基因开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,PCR扩增获得cry2Ab 完整ORF,与大肠杆菌表达载体pET-21b连接,构建了重组表达质粒pET-2Ab4,质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实该基因表达了60kD的蛋白,生物测定表明,Cry2Ab4对棉铃虫和大豆食心虫具有高毒力,同时对小菜蛾和二化螟有一定的杀虫活性,而对亚洲玉米螟和甜菜夜蛾没有杀虫活性。     

苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究

以我室自行分离的对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88为材料,用PCR-RFLP方法从其质粒DNA文库中筛选到含cry2Ab基因的一个阳性克隆pZF858,序列测定发现,该片段含有cry2Ab全长基因,开放读码框为1902bps,编码由633个氨基酸组成的70.7kD蛋白,氨基酸同源性与已公布的cry2Ab基因同源性均为99.8％,经Bt基因国际命名委员会正式命名为cry2Ab。根据cry2Ab基因开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,PCR扩增获得cry2Ab 完整ORF,与大肠杆菌表达载体pET-21b连接,构建了重组表达质粒pET-2Ab4,质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实该基因表达了60kD的蛋白,生物测定表明,Cry2Ab4对棉铃虫和大豆食心虫具有高毒力,同时对小菜蛾和二化螟有一定的杀虫活性,而对亚洲玉米螟和甜菜夜蛾没有杀虫活性。     

棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性及交互抗性研究

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)对Bt(Bacillus thuringiensis)的抗性问题是阻碍Bt抗虫棉持续发展的关键,探究棉铃虫对不同Bt蛋白的抗性演化趋势及交互抗性,可为选择合适的抗虫棉花备选基因提供参考。【方法】在室内通过连续多代筛选,获得了5个对Bt具有不同抗性的品系,利用饲料混合法测定了这些品系棉铃虫的交互抗性。【结果】经筛选后棉铃虫对Cry1Ac产生了超高水平的抗性、对Cry2Ab、Vip3Aa产生了超低抗性(耐性);Cry1Ac抗性棉铃虫停止筛选而换成Cry2Ab或Vip3Aa继续筛选后,棉铃虫对Cry1Ac抗性水平明显降低,对Cry2Ab或Vip3Aa产生低抗或超低抗性(耐性)。Cry1Ac抗性棉铃虫对Cry1Ab敏感性显著降低,而对Cry2Ab、Cry2Ah及Vip3Aa敏感性变化不显著;Cry2Ab抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性显著降低;Vip3Aa抗性品系棉铃虫对Cry1Ac敏感性变化不显著。说明Cry1Ac与Cry1Ab间存在明显交互抗性,与Cry2Ah、Vip3Aa没有交互抗性;而Cry2Ab与Cry1Ac间存在不对称的交互抗性。【结论】在筛选新杀虫基因或叠加基因时,应充分考虑抗性发展及交互抗性问题,Cry2Ah、Vip3Aa是治理Cry1Ac抗性棉铃虫或与Cry1Ac叠加最优的选择。     

cry4Aa、cry4Ba和cry11Aa基因在苏云金杆菌无晶体型菌株中的表达

利用穿梭载体pBU4,将苏云金杆菌以色列亚种 (Bti)的cry4Aa、cry4Ba和cry11Aa基因分别转入Bti无晶体突变株 4Q7中 ,获得了转化菌株Bt B60 1、Bt B61 1和Bt B640。SDS PAGE结果显示 :Cry4Aa、Cry4Ba和Cry11Aa蛋白均分别获得了表达。透射电镜下观察 ,转化菌株能产生球形或菱形伴胞晶体。转化菌株对敏感和抗性致倦库蚊及白纹伊蚊幼虫的生物测定结果显示 :Cry4Aa、Cry4Ba和Cry1 1Aa蛋白对     

单增李斯特菌vip基因缺失

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是广泛存在于自然界及食物中的食源性致病菌,作为胞内寄生菌,它可以引起强烈的细胞免疫,是潜在的优良疫苗载体。vip是单增李斯特菌的毒力基因,与其侵袭能力密切相关。因此构建vip基因敲除株可为单增李斯特菌疫苗载体的研发打下重要基础。从单增李斯特菌EGDe基因组中扩增出vip基因上、下游序列,连接到穿梭载体pKSV7中得到敲除载体pKSV7-Δvip,将其以电穿孔的方式转入单增李斯特菌后,通过同源重组利用氯霉素和温度双重压力筛选得到vip基因的敲除突变株,并对敲除菌株的生长曲线进行分析发现vip敲除对细菌的生长没有显著影响,为进一步研究vip基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发提供参考。     

梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) hnr基因的克隆及其对侵染结构分化的调控

【背景】羟基萘还原酶(hydroxynaphthalene reductase,HNR)是1,8-间苯二酚(1,8-dihydroxynaphthalene,DHN)黑色素合成途径中起关键作用的酶,研究表明HNR不仅参与真菌黑色素合成,而且对其生长发育及致病性也具有一定的调控作用,但HNR对真菌病原物侵染结构分化的调控研究鲜见报道。【目的】在对梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) HNR的基因进行克隆与生物信息学分析的基础上,通过药理学方法初步探讨HNR对A.alternata生长及侵染结构分化的调控作用,为进一步揭示HNR在A.alternata侵染结构分化形成过程中的分子机制提供理论依据。【方法】对梨果黑斑病菌A.alternata的2个hnr基因进行了克隆;通过gene structure display server、open reading frame (ORF) Finder及conserved domain search等数据库及相关软件,对hnr基因及蛋白进行生物信息学分析,并利用HNR特异性抑制剂三环唑处理分析其对A.alternata生长发育、黑色素合成和侵染结构形成的影响,同时采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析了hnr基因在A.alternata不同侵染结构分化时期的表达特性。【结果】从梨果黑斑病菌A.alternata克隆得到2个羟基萘还原酶基因hnr的编码区全长,分别命名为Aa4hnr和Aa3hnr,其中Aa4hnr基因全长为1 266 bp,编码了268个氨基酸,无内含子,有9个ORF;Aa3hnr基因全长为1 356 bp,编码了267个氨基酸,含有2个大小分别为51 bp和49 bp的内含子,有17个ORF;进化分析表明,Aa4hnr和Aa3hnr与Ophiobolus disseminans和Alternaria arborescens分别具有较高的一致性,同时Aa4hnr和Aa3hnr编码的蛋白均含有NAD (P)结合域,属于短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)家族。药理学结果表明,三环唑处理显著降低了A.alternata DHN黑色素的生物合成,抑制了疏水性诱导的A.alternata侵染结构的形成;进一步分析Aa4hnr和Aa3hnr在疏水表面诱导的A.alternata孢子萌发阶段(2 h)、附着胞形成阶段(6 h)、侵染菌丝形成阶段(8 h)的基因表达量,Aa4hnr的基因表达量在A.alternata侵染结构分化的各个时期均发生下调,Aa3hnr在附着胞形成阶段(6 h)表达量下调,然而在侵染菌丝形成阶段(8 h)显著上调表达。【结论】Aa4hnr和Aa3hnr对梨果黑斑病菌侵染具有一定的调控作用。     

苏云金芽孢杆菌新型营养期杀虫蛋白Vip3A研究

营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Protein,Vip）Vip3A是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在营养生长对数中期分泌产生的一类新型杀虫蛋白。Vip3A广泛存在于Bt中,与晶体杀虫蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）没有任何同源性,不具有多样性,在遗传上比较保守。其N-端存在一趋化信号传导因子相似序列,C-端存在着纤维素结合结构域。Vip3A蛋白通过诱发细胞凋亡,最终导致细胞死亡,这与Bt δ-内毒素的作用机理完全不同。本文主要对Vip3A杀虫蛋白的发现、特性及作用机理作一简要综述。     

苏云金杆菌Vip蛋白经历正向达尔文选择的证据

营养期杀虫蛋白(Vip)是苏云金杆菌在营养期所产生的一类新型杀虫蛋白,代表了第二代转基因杀虫蛋白,它能在一定程度上克服许多害虫对δ-内毒素低敏感或者不敏感的缺陷。但是,目前和已经深入研究的δ-内毒素相比较,有关Vip蛋白结构和功能关系方面的报道还甚少。本文采用最大似然方法和基于最大简约的滑窗分析对Vip蛋白的分子进化机制进行了评价。结果发现Vip蛋白在进化过程当中经历了正选择,并采用贝叶斯方法确定了16个正选择氨基酸残基。有意思的是所有这些正选择残基都位于Vip蛋白C端从705到809的区域。当把这些正选择残基定位到二级结构和三级结构时,发现绝大部分正选择残基都暴露在Vip蛋白空间结构的表面并且聚集在环的区域。推测Vip蛋白分子进化的机制应该是受到了正选择压力而不是功能约束的松弛。导致Vip蛋白C端多样性的潜在正选择压力可能是Vip蛋白为了在和目标昆虫之间竞争取得优势,或者是为了扩大Vip蛋白的杀虫范围。文中确定的经历了正选择残基很有可能是和昆虫宿主范围有关,因此可以为今后研究Vip蛋白的结构和功能提供相应的靶点。     

Bt9816C培养上清中杀虫活性成分的研究*

Bt98 1 6C的培养上清对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性。热敏实验表明 β -外毒素和ZwittermicinA不是其主要杀虫活性成分。Bt981 6C的无晶体株保留有卵磷酯酶C和溶血素活性 ,但是不再具有vip3A基因 ,其培养上清也丧失了杀虫活性。SDS -PAGE结果显示Bt981 6C培养上清中有Vip3A蛋白特征大小的 89kD的蛋白 ,而其无晶体株正好缺失了该蛋白。以上结果表明Bt981 6C培养上清中主要的杀虫活性成分是Vip3A蛋白。     

油茶DELLA基因的克隆和表达分析

为了解油茶(Camellia oleifera)中DELLA基因功能及其表达特性,采用PCR技术从‘长林4号’油茶中克隆了5个DELLA基因,命名为CoDELLA1~CoDELLA5,对其编码的5个CoDELLA蛋白进行生物信息学分析,并对5个DELLA基因的表达模式以及激素响应活性进行了分析。结果表明,5个CoDELLA基因的编码区长度分别为1 791、1 875、1 848、1 593和1 581 bp,分别编码597、625、616、531和527个氨基酸。5个CoDELLA蛋白的氨基酸序列相似度较高,丝氨酸残基为主要的潜在磷酸化位点,CoDELLA蛋白N端均含有典型的DELLA结构域。不同物种中DELLA蛋白的系统发育存在差异,CoDELLA与茶树的CsDELLA同源性最高。CoDELLA基因在油茶不同组织中的表达也存在差异,且赤霉素和独脚金内酯等多种激素和非生物胁迫对其表达具有调控作用。CoDELLA基因可能在油茶的生长发育和非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

一种新的对鳞翅目昆虫具有广谱活性的苏云金杆菌杀虫蛋白──Vip3A

1996年Estruch等报道了一种由苏云金杆菌BacillusthuringiensisBerliner（下略为Bt）AB88株和AB424株产生的新杀虫蛋白,分别称为Vip3A（a）和Vip3A（b）[详见Proc．Natl。AcadSci.USA93（11）：5389～5394]。Vip3A杀虫蛋白有以下几个特点：（1）它是在Bt的营养体生长阶段产生并分泌到培养液中的。（2）它是不耐热的,95℃处理20分钟便失活。（3）它由791个氨基酸组成,分子量为88．5kD。Vip3A（b）是Vip3A（a）的同系物,两者98％的氨基酸相同,只有5个氨基酸不同。（4）Vip3A杀虫蛋白基因可以在大肠杆菌＆cherichiacoliCastel…     

对鳞翅目害虫高毒力的Bt cry1Aa基因的分离克隆及表达

Bt菌Ly30株是我国自行分离的对多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌,经CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)系统鉴定,它含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法, 设计一对特异引物,分别引入NcoⅠ和BamHⅠ/NcoⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因,与表达载体Pkk233-2相应酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Aa基因重组质粒pKKLy1Aa。完成了该基因的亚克隆和序列测定,结果表明,该基因的编码区为3 531 bp,编码蛋白分子量为133.2kD,含1.176个氨基酸,等电点Pi为4.99。该基因序列已在GenBank中登记注册,登录号为AF384211,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Aa12。对重组菌KKLy1Aa进行诱导表达研究。在0.6 mmol/L IPTG、37℃、8 h培养条件下,该基因获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的133.2 kD蛋白带。室内生测结果表明,Cry1Aa蛋白对不同的小菜蛾品系均有较高的杀虫活性,其LC₅₀值分别为0.203 μg/mL和0.554 μg/mL。