苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bt菌株和41个Bt标准菌株中筛选到39株即约25%的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析,发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89 kD大小的蛋白,其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株,即S101和611,并分别进行vip3A基因的克隆和测序,再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较,结果表明,vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个vip3A基因即vip3AS101和vip3A611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-611,转化到大肠杆菌M15,经1 mmol/L IPTG诱导后均表达89 kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明,Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48%和35%的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-611蛋白和已报道的Vip3A-S184蛋白对初孵斜纹夜蛾 (Spodoptera litura) 幼虫进行生物测定,结果表明,3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异,这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ,Bt)菌株S184中克隆了2.3kb大 vip3A基因并进行了序列分析。将vip3A-S184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19％是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）,斜纹夜蛾（S.litura)和棉铃虫（Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3A-S184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bl菌株和41个Bl标准菌株中筛选到39株即约25％的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析,发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89kD大小的蛋白,其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株,即S101和6ll,并分别进行vip3A基因的克隆和测序,再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较,结果表明,vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个却3A基因即vip3A—S101和vip3A-611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-6ll,转化到大肠杆菌M15,经lmmol／L IPTG诱导后均表达89kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明,Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48％和35％的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-6ll蛋白和已报道的Vip3A—S184蛋白对初孵斜纹夜蛾(Spodoptera litura)幼虫进行生物测定,结果表明,3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异,这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。     

利用绿色荧光蛋白基因gfp研究芽胞杆菌的启动子活性

利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3,分别标记苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的cry3A启动子Pcry3A、BtI_BtII启动子PBtI_BtII和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P44-12以研究其表达差异。其中,Pcry3A和PBtI_BtII分别与gfpmut3构成融合基因,以调控gfpmut3在苏云金芽胞杆菌中的表达。将重组质粒pGFP_304(含P44-12)、pGFPExpA(含Pcry3A_ gfpmut3融合基因)和pGFPExpB(含PBtI_BtII_ gfpmut3融合基因)分别导入大肠杆菌(Escherichia coli)和苏云金芽胞杆菌后发现,P44-12和PBtI_BtII在大肠杆菌与苏云金芽胞杆菌中均可表达gfpmut3,其中PBtI_BtII在大肠杆菌中具有极强的启动基因表达的能力。而Pcry3A不能启动gfpmut3在大肠杆菌中表达,在苏云金芽胞杆菌中启动的gfpmut3表达的荧光强度也较弱。进一步通过荧光显微镜和生物活性检测器对含重组质粒pGFP_304、pGFPExpA和pGFPExpB的转化子分别进行荧光检测及微量热检测。结果表明,3种启动子驱动下的gfpmut3基因均可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中表达并检测得到不同的发光类型。微量热法检测发现P44_12和PBtI_BtII启动gfpmut3表达的代谢热低于Pcry3A驱动gfpmut3表达的代谢热。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。     

苏云金杆菌辅助蛋白P20对杀虫晶体蛋白Cry1Ab表达的影响

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab因其C半端缺少了一段含4个半胱氨酸的氨基酸序列而导致蛋白的不稳定,报道苏云金杆菌辅助蛋白P20帮助Cry1Ab蛋白的表达及晶体的形成。利用穿梭载体pHT3101构建3个表达质粒,即pT1B、pP1B和pDP1B,3个质粒都含有cry1Ab基因,不同在于pT1B没有p20基因,pP1B含有p20全基因,而pDP1B不仅含有p20全基因,且在p20基因前插入cry1A?启动子。分别将这3个表达质粒经电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型菌株CryB中,获得转化菌株T1B、P1B和DP1B。Western blot表明cry1Ab基因在这3株菌中均表达了130 kD的蛋白,部分降解为大约60 kD的蛋白。蛋白定量分析显示,3株菌130 kD蛋白量的比为1∶1.4∶1.5,降解后的60 kD蛋白量的 比为1∶1.1∶1.6,Cry1Ab蛋白总量的比为1∶1∶2∶1.6。镜检发现,Cry1Ab在3株菌中都形成典型的菱形晶体,其晶体大小为T1B Helicoverpa armigera）均具有明显的杀虫活性,三者的LC₅₀差异不显著。研究表明,P20对cry1Ab基因的表达和晶体形成均有帮助,P20表达量的多少可能是导致Cry1Ab蛋白最终产量有所不同的因素。     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N末端测序和基因核苷酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S层蛋白可以形成伴胞晶体。     

新vip3Aa基因的克隆、表达及其序列分析

克隆了Bt9816C的vip3A基因，并将测序结果提交到GenBank (序列号：AY945939)。该基因是一个新的vip3Aa基因, Bt杀虫晶体蛋白命名委员会将其命名为vip3Aa18。在大肠杆菌BL21中表达了该基因，生物测定结果表明纯化的Vip3Aa18蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性。序列分析结果显示Vip3Aa18 C端536至667位氨基酸残基间是一个糖类结合域，推测可能参与Vip3Aa18与敏感昆虫中肠受体结合；N端272至292位氨基酸残基间存在一个跨膜螺旋，可能与Vip3Aa18形成穿孔有关。此外，Vip3Aa18还可能具有一个二硫键。这些特殊区域和位点可能与其功能密切相关。     

新vip3Aa基因的克隆、表达及其序列分析

克隆了Bt9816C的vip3A基因,并将测序结果提交到GenBank (序列号：AY945939)。该基因是一个新的vip3Aa基因, Bt杀虫晶体蛋白命名委员会将其命名为vip3Aa18。在大肠杆菌BL21中表达了该基因,生物测定结果表明纯化的Vip3Aa18蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾具有很高的杀虫活性。序列分析结果显示Vip3Aa18 C端536至667位氨基酸残基间是一个糖类结合域,推测可能参与Vip3Aa18与敏感昆虫中肠受体结合;N端272至292位氨基酸残基间存在一个跨膜螺旋,可能与Vip3Aa18形成穿孔有关。此外,Vip3Aa18还可能具有一个二硫键。这些特殊区域和位点可能与其功能密切相关。     

人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体（HBscFv）。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因,亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中,线性化后转化P. pastorisGS115;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现,重组HBscFv可以在α因子的引导下,分泌至培养基中,产量为80mg/L;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性,活性总量在诱导培养72h后达最高峰,在诱导培养后期,HBscFv活性下降;PAS糖显色结果表明,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。     

带cry3Aa启动子的aiiA基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

N-乙酰高丝氨酸内酯（N-cyl-homoserine lactones,AHLs）,是一类数量感知（Quorum-sensing）系统中的信号分子,它参与诱导调控许多植物病原菌致病基因的表达。苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白能降解这类AHLs分子,进而可减弱病原菌致病基因表达产生的病害。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa的启动子是一种不依赖芽胞形成的启动子,它相对于其它cry类基因的启动子有启动基因转录时间早,转录时间长的优点。通过重叠延伸PCR,用杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子替换编码AiiA蛋白的基因aiiA自身的启动子,构建了融合基因pro3A-aiiA。将融合基因装入穿梭载体pHT304的BamHI/SphI位点,得到重组质粒pBMB686并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株BMB686的AiiA蛋白表达量在各个生长时期均高于对照菌株,对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力也明显优于对照菌株。     

寄生疫霉parA1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据已报道的寄生疫霉(Phytophthora parasitica)parA1基因的序列设计引物,从4株寄生疫霉中国菌株(3株来自烟草,1株来自刺槐)中克隆到此基因并进行了重组表达。序列分析表明4株寄生疫霉parA1基因序列高度保守。对表达载体pET30a(+)双酶切,构建表达Parasiticein蛋白的表达载体pETeli,用CaCl\-2法转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,通过诱导在大肠杆菌中进行非融合表达,表达产物在烟草上引起过敏性反应。性质测定表明,表达产物有一定的耐热性,并对蛋白酶K敏感。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS-PAGE蛋白电泳表明在39.9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以 Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该399kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36.9 kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为疫苗的候选成份提供理论基础。     

绿色荧光蛋白基因标记野生型生防枯草芽孢杆菌的研究

根据绿色荧光蛋白基因和枯草芽孢杆菌木糖诱导型启动子PxylR 序列,分别设计两对特异引物primers PxyF/R和primers gfpF/R,扩增获得了完整的启动子PxylR和-gfp基因序列。进一步以上述产物混合物为模板,以primer PxyF/primer gfpR做引物进行重迭PCR,获得了PxylR-gfp重组翻译融合表达盒。经SphⅠ和KpnⅠ完全酶切后,将PxylR-gfp表达盒分别插入大肠杆菌_苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315和大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭载体pRP22。相应的重组表达质粒pGFP315和 pGFP22转化枯草芽孢杆菌感受态细胞。前者在标准菌株168中得到良好发光表型,后者则在标准菌株168和野生目标菌株B916中均得到良好的发光表型。室内平板抑菌实验结果显示B916生防效果与出发菌株没有明显差异,遗传稳定性研究表明连续稀释培养约175代后,工程菌株稳定性为94%,质粒丢失频率低于3.5×10^-4/代。     

DNA错配修复基因mutS的高效表达及表达产物活性鉴定

将DNA错配修复基因mutS（2.56kb）克隆于分泌型原核表达载体pET32a（+）上,以N端融合6个组氨酸的形式在E.coliAD494(DE3) 中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析证实有一与预期分子量相应的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的35％左右,且表达蛋白以可溶形式存在。利用固定化金属离子（Ni²⁺）配体亲和层析柱纯化目的蛋白,其纯度为90％以上。与含有错配碱基DNA双链的结合反应证明该蛋白具有特异性识别、结合含有错配碱基DNA双链的生物活性。     

苏云金芽孢杆菌δ－内毒素crylA?基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )δ－内毒索crylA?全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK223-3重组,并引入大肠杆菌JMl09中,经IPTG诱导．获得了超量表达的CryIA?蛋白。将crylA?全长基因插入链霉菌表达载体pHZl272中,得到重组质粒pHZl256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyces　lividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导．通过Westerablotting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZl256)已表达出相应的CrylA?蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ－内毒索crylA?对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93％和57％。     

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的鉴定、克隆及活性分析

【目的】鉴定我国自行分离的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）菌株中vip3A基因的分布和基因型,从其中对鳞翅目幼虫表现高毒力的Bt菌株中克隆vip3Aa基因。【方法】利用PCR-RFLP方法确定vip3A基因的分布和鉴定基因型,利用PCR方法克隆vip3A全长基因。【结果】171株野生型Bt菌株中共鉴定出63株含有vip3A基因,均与vip3Aa1类基因相似。从TF9和Bt16菌株中克隆得到2个vip3Aa基因,分别构建了携带vip3Aa基因的表达载体p30vip-26和p30vip-27,SDS-PAGE和Western Blot分析表明,IPTG诱导后均可表达88 kDa左右的Vip3A蛋白,蛋白可溶性分析表明约10%可溶。这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为vip3Aa26和vip3Aa27。生物测定结果显示,Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）3种重要鳞翅目害虫初孵幼虫的毒力较高,LC50值分别为0.125 μg/mL,0.238 μg/mL和9.238 μg/mL。而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾有活性,LC50值为4.423 μg/mL。【结论】本研究中的Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫均能表现高杀虫活性,而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾幼虫有活性,实验结果表明Vip3A蛋白个别氨基酸的变化对其杀虫活性影响很大。     

B.t.c. cry1C全长基因的克隆及其在增产菌中的表达*

设计的一对引物 ,对苏云金芽孢杆菌科默尔亚种 (Bacillusthuringiensissubsp .colmeri)1 5A3菌株中的cry1C基因进行PCR扩增 ,得到包括结构基因 ,调节基因在内的全长为40kb的PCR产物。经两步克隆 ,将此基因连接至穿梭表达载体pHT315上 ,得到重组质粒pHT 1C。通过电转化将其导入一株增产菌蜡状芽孢杆菌 (Bacilluscereus) 9509菌株 ,SDS-PAGE检测到 1条 60kD左右的蛋     

节杆菌BT801基因文库构建及其乙内酰脲酶基因分离与表达

L-乙内酰脲酶产生菌节杆菌 BT801的染色体DNA经Sau3A I 部分酶切后分离30kb左右的片段,与经HpaI和PstI酶切的黏粒载体Pkc505进行连接,将连接产物用包装蛋白包装,转染大肠杆菌DH5α得到10 000多个转化子,构建成节杆菌BT801的基因组文库。通过薄层层析等方法筛选得到了1个阳性克隆,通过亚克隆得到了乙内酰脲酶的完整基因,该基因能分别利用自身的启动子和T5启动子在大肠杆菌中进行表达产生有活性的蛋白。