应用PAMAM dendrimers作为DNA运送载体的体外研究

Starburst^TM PAMAM dendrimers分子是一类新型的高分枝、辐射状对称的树状高分子,在生理条件下其表面具有高密度的正电荷,可以通过静电相互作用与核酸形成复合物后,介导遗传物质进入细胞.研究了G3, G3.5, G5, G7, G7.5, G9各代dendrimers分子与DNA结合后介导其转染细胞的能力,并初步评价这种复合物转染对细胞活力的影响.实验证实,全代的PAMAM dendrmers皆可与DNA结合,并可在体外培养的细胞中介导高效的DNA转染.PAMAM dendrimer/DNA复合物很稳定,在较大的pH值变化范围内(pH 2～10)不解离.PAMAM dendrimers可保护与之复合的DNA分子免受限制性内切酶的降解.在一定的电荷比范围内,高代数的dendrimers分子与DNA形成的复合物对培养细胞的转染效率高于低代数dendrimer分子,复合物所介导的转染效率在不同的细胞系之间也有差异.在有效作用浓度范围内（≤1.3×10^-1 g/L）,PAMAM dendrimers/DNA复合物对被转染细胞无毒性.但是,未与DNA复合的dendrimers分子在较低浓度时则表现出毒性,表明Starburst^TM PAMAM dendrimers分子可作为新型的低毒非病毒DNA载体,用于介导DNA对体外培养细胞的转染. 这些前期观察,为将纳米级高分子聚合物dendrimers分子作为基因转运载体应用于体内提供了初步的实验依据.     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用

将构建的营养期杀虫蛋白基因vip3表达质粒pBMB2328和含杀虫晶体蛋白基因(crylAc10或crylCa)质粒同时电转化无质粒突变株BMB171并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证,分别得到含crylAc10和vip83、crylCa和vip83的双基因重组菌BMB2830-171和BMB2882-171。用单基因重组菌作对照,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白CrylAc10和Cry1Ca两组蛋白对3种重要鳞翅目害虫毒力。经统计分析,结果表明两组杀虫蛋白Vip83与CrylAc10和Vip83与CrylCa之间对棉铃虫均存在拮抗作用,对甜菜夜蛾协同作用不明显;但对小菜蛾前协同作用不明显,而后则有增效作用,其共毒系数为32．6。双基因的遗传稳定性检测表明这种正负协同关系具有一定的分子遗传稳定性,可为高效广谱工程菌的构建提供依据。     

类器官组织在感染性疾病研究中的应用

类器官(organoid)是体外3D培养组织干细胞所形成的多功能细胞团,具有自身增殖和多向分化的能力,在空间和结构上与来源器官组织的基因、结构和功能相似,可用于模拟体内组织细胞生长、分化及器官形成过程,在药物筛选与评价、生物医学材料及组织工程等方面具有重要的应用潜能。当前在感染性疾病研究方面,越来越多数据表明不同类器官组织可用于在体外模拟病原入侵和引发疾病过程。鉴于此,本文对类器官组织在病原感染相关疾病模型上的研究进展及其应用前景进行综述。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

人类肿瘤病毒介导缺氧信号致病机制的研究进展

病毒感染与多种肿瘤的发生发展密切相关,病毒入侵宿主细胞后常引发多个关键细胞信号通路的调控紊乱,其中对缺氧信号的调控尤为重要,日益受到关注。本文主要介绍各种常见人类肿瘤病毒如何通过编码毒蛋白篡改缺氧诱导因子(HIF)信号通路,以及在应答缺氧微环境时如何诱发肿瘤发生发展分子机制的研究进展,并概括肿瘤病毒介导HIF信号通路及其对缺氧应激反应的共有模式,提示肿瘤病毒调控缺氧信号诱发癌症的潜在治疗靶点和策略。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用*

将构建的营养期杀虫蛋白基因vip83表达质粒pBMB2 32 8和含杀虫晶体蛋白基因(cry1Ac1 0或cry1Ca)质粒同时电转化无质粒突变株BMB1 71并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证 ,分别得到含cry1Ac1 0和vip83、cry1Ca和vip83的双基因重组菌BMB2 830 1 71和BMB2 882 1 71。用单基因重组菌作对照 ,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白Cry1Ac1 0和Cry1Ca两组蛋白对 3种重要鳞翅目害     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因特性分析

营养期杀虫蛋白是在苏云金芽胞杆菌营养期中发现的一种非晶体状胞外杀虫蛋白 .通过Southern杂交的基因定位实验 ,证实了营养期杀虫蛋白基因并非位于染色体和环型质粒上 ;在 2 0个不同血清型的 2 3种菌株中 ,营养期杀虫蛋白基因的存在率为 5 6 5 % (13 2 3) .同时对随机选择的 3个不同亚种菌株进行基因克隆和序列分析 ,表明其基因具有相当高的同源性 .运用生物信息技术 ,对营养期杀虫蛋白多肽进行了功能结构域比对分析 ,发现这 789多肽蛋白的N端 31至 15 0残基之间存在一种趋化信号传导因子相似序列 ,C端 5 36至 6 6 6残基之间则存在着纤维素结合结构域相似肽 .上述结果提示 ,营养期杀虫蛋白基因在苏云金芽胞杆菌天然菌株中高度保守并较为广泛分布 ,其编码蛋白的特殊结构提示了营养期杀虫蛋白潜在的功能特性 ,为进一步研究营养期杀虫蛋白奠定了基础 .     

基因人工进化的分子育种技术

分子育种技术(molecular breeding technology)利用人工手段模拟生物杂交优势的分子进化模式,在体外构建含有感兴趣基因的大量突变文库,并根据基因表达产物的特性,以合适的筛选方法选择具有最佳功能的改良基因。经过近几年的快速发展,分子育种技术在创造高效随机基因突变库的方法上日臻完善,已在医学、工业和环境保护酶类研究等方面收到了很好的成效。预计未来该技术将广泛地应用于重要传染性疾病(如疟疾、艾滋病病毒等)的预防和治疗,尤其可通过DNA疫苗手段的应用而获得强大的生命力。作者全面地综述了分子育种技术的产生、发展和应用现状。