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将构建的营养期杀虫蛋白基因vip3表达质粒pBMB2328和含杀虫晶体蛋白基因(crylAc10或crylCa)质粒同时电转化无质粒突变株BMB171并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证,分别得到含crylAc10和vip83、crylCa和vip83的双基因重组菌BMB2830-171和BMB2882-171。用单基因重组菌作对照,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白CrylAc10和Cry1Ca两组蛋白对3种重要鳞翅目害虫毒力。经统计分析,结果表明两组杀虫蛋白Vip83与CrylAc10和Vip83与CrylCa之间对棉铃虫均存在拮抗作用,对甜菜夜蛾协同作用不明显;但对小菜蛾前协同作用不明显,而后则有增效作用,其共毒系数为32.6。双基因的遗传稳定性检测表明这种正负协同关系具有一定的分子遗传稳定性,可为高效广谱工程菌的构建提供依据。 相似文献
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苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析 总被引:9,自引:0,他引:9
选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4~5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC50值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。
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利用电脉冲将cry1C基因转入苏云金芽孢杆菌野生菌株YBT1535,筛选得到3个转化子。质粒电泳、PCR扩增及Southern杂交结果均证明,基因cry1C已转入菌株YBT1535。生物测定结果表明,3个转化子对甜菜夜蛾的毒力比出发菌YBT1535均有显著的提高,转化子YBT1535-1和YBT1535-3对小菜蛾和棉铃虫的生物活性与出发菌YBT1535相近,而转化子YBT1535-2则有一定幅度的提高。 相似文献
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利用PCR技术直接鉴定苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型的快速方法 总被引:3,自引:0,他引:3
根据PCR程序中热变性温度可使菌体裂解,释放出DNA的原理,利用苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白不同基因型的特异混合引物,对苏云金芽孢杆菌营养体直接进行PCR分析。根据不同基因型的特异扩增产物片段的分子量大小便可直接确定该苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的基因型。本文对本室筛选天然菌株和苏云金芽孢杆菌克隆菌株分别进行了cryl基因的PCR分析。表明,该法结果可靠快速易行,在方法学上,为苏云金芽孢杆菌菌株鉴定、新菌株的筛选和基因型分析提供了极大的方便。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌cry1基因在荧光假单胞菌Pfx-18中的表达特性 总被引:1,自引:1,他引:0
用DIG标记的cry1Aa基因EcoRI-F片段的RNA探针,对筛选的鳞翅目高毒力菌株的质粒进行Southern分析,将cry基因定位在39.3MD质粒上。该质粒经HindⅢ酶解,用同样探针进行杂交,呈现6.5kb和7.1kb两条阳性带,其中7.1kb片段的杂交强度明显高于6.5kb片段。将7.1kb片段与多寄主质粒pSUP106连接,转化荧光假单胞菌Pfx-18,获得克隆子LZP-1。克隆基因用PCR鉴定,显示典型的cry1Ab谱带。经SDS-PAGE分析,克隆株表达66kD杀虫晶体蛋白和一些小分子多肽。其发酵液稀释1000倍对三龄小菜蛾幼虫的致死率为33%。 相似文献
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将对鞘翅目昆虫有特异毒性的苏云金芽孢杆菌cry3A基因电转化到只对鳞翅目昆虫有毒性的苏云金芽孢杆菌野生型菌株YBT8031中,获得转化了BMBY001。SDSPAGE分析及镜检结果表明,cry3A基因可在该菌株中高效表达,但出发菌株中原有的cry1Ab、cry1Ac及cry2的表达则受到不同程度的影响。生物测定结果显示,转化子BMBY001对柳蓝叶甲(鞘翅目)具有较高毒力,LC50为0413μL/mL(浸叶法),对小菜蛾(鳞翅目)的毒力比野生受体菌YBT8031有所降低,LC50值为3319μL/mL。 相似文献
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苏云金芽胞杆菌杀蚊基团在鱼腥藻中克隆和表达的初步研究 总被引:1,自引:0,他引:1
将苏云金胞杆菌以色列亚种的杀蚊晶体蛋白基因cry11A亚克隆到大肠杆菌-蓝藻的穿梭质粒载体pERL25C然后用三亲本杂交的方法将重组质粒转移到一种具有固氮能力且可被蚊幼虫蚕食的鱼腥藻(Anabaena)PCC7120中,Southernblot及Westernblot分析表明cry11A基因在鱼腥藻PCC7120中得以克隆和表达,但生物测定未能检测到转基因鱼腥藻对库蚊(Culex)的毒性,可能是因 相似文献
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以含有P19和cyt1A基因的以色列亚种72MD质粒的9
7kb HindⅢ片段为模板进行PCR扩增,分别获得P19基因和cyt1A基因片段。与表达
载体pUHE24连接转化大肠杆菌XL1,获得3个克隆株。LZ19含有P19基因;pLZcyt1A含
有cyt1A基因;LZ19A含有P19和cyt1A两个基因。利用cyt1A蛋白质可使大肠杆菌细胞致
死的特性,在IPTG诱导下,测定了各克隆基因表达对大肠杆菌有致死作用;pLZ19A对大肠杆菌的起始致死作用明显快于pLZcyt1A,这种现象可能是P19基因促进cyt1A基因高表达的结果。 相似文献
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在研究苏云金芽孢杆菌基因克隆和表达时,发现当把以色列亚种P19和cytA蛋白基因的重组质粒转入大肠杆菌MV1190后,cytA蛋白基因起始密码上游第18位碱基至下游第48位碱基之间缺失约30个碱基,导致cytA蛋白生物活性丧失。同样也发现,把大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT3101转化大肠杆菌TG1时,其载体中约1.6kb片段也发生类似缺失事件,说明大肠杆菌细胞对某些异源基因片段具有不相容性。 相似文献