苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测及保守性分析

Vip3A蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在营养期分泌的一类新型杀虫蛋白。用PCR方法从114个Bt菌株和41个Bt标准菌株中筛选到39株即约25%的菌株含有vip3A基因。利用所制备的Vip3A蛋白的多克隆抗体对以上含有vip3A基因的Bt菌株进行Western印迹分析，发现多数PCR反应为阳性的菌株都产生89 kD大小的蛋白，其中有4株没有Vip3A蛋白的表达。从以上菌株中挑选2个对夜蛾科害虫具有较高和较低毒力的菌株，即S101和611，并分别进行vip3A基因的克隆和测序，再与GenBank上所登录的其它6个全长vip3A基因和2个已报道的但未登录GenBank的vip3A基因进行核苷酸和氨基酸序列比较，结果表明，vip3A是一个极其保守的基因。将以上所克隆的2个vip3A基因即vip3AS101和vip3A611分别插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP-S101和pOTP-611，转化到大肠杆菌M15，经1 mmol/L IPTG诱导后均表达89 kD大小的Vip3A蛋白。蛋白可溶性试验表明，Vip3A-S101和Vip3A-611分别有48%和35%的蛋白是可溶的。将Vip3A-S101和Vip3A-611蛋白和已报道的Vip3A-S184蛋白对初孵斜纹夜蛾 (Spodoptera litura) 幼虫进行生物测定，结果表明，3个Vip3A蛋白对斜纹夜蛾幼虫毒力没有显著性差异，这说明了Vip3A个别氨基酸的变化对蛋白的杀虫活性没有影响。