亚氨基酸编码方法及其应用

赋予氨基酸编码方法下除终止子之外的密码子突变为终止子时每一位发生的变化权值,利用矩阵来表示所有的突变方式和难易程度,综合亲水性与疏水性理化性质,提出亚氨基酸编码方法,并给出该编码方法下同义密码子的相对使用度fSubtypesRelativeSynonymousCodonUsage,SRSCU）．然后选取15条H5N1序列,使用MEGA4．0分析它们的同源性,并分别在氨基酸编码、拟氨基酸编码、亚氨基酸编码这三种环境下研究所选序列使用密码子的偏好性,对比结果验证,亚氨基酸编码方法具有相应的优越性．     

大肠杆菌mRNA编码区长度、形成二级结构倾向与密码子偏好性的关系

从GenBank获得大肠杆菌K-12MG1655株的全基因组序列,计算了与基因密码子偏好性相关的多个参数(Nc、CAI、GC、GC3s),对其mRNA编码区长度、形成二级结构倾向与密码子偏好性之间的关系进行了统计学分析,发现虽然翻译效率(包括翻译速度和翻译精度)是制约大肠杆菌高表达基因的密码子偏好性的主要因素,同时,mRNA编码区长度及其形成二级结构的倾向也是形成这种偏好性的不可忽略的原因,而且对偏好性有一定程度的削弱。另外对mRNA编码区形成二级结构倾向的生物学意义进行了讨论分析。     

大肠杆菌gdhA基因的密码子偏好性分析及优化

本研究对10种生物的谷氨酸脱氢酶gdh A基因分别进行了针对单独生物的密码子使用偏好性的分析并进行了比较。分析结果表明:在10种生物中,gdh A基因在编码时对密码子的使用存在较大不同,水稻、痢疾杆菌、柠檬酸杆菌、大肠杆菌的有效密码子数(effective number of codons,ENc)值均在40左右,说明水稻、痢疾杆菌、柠檬酸杆菌、大肠杆菌的密码子使用偏好性较强;其余6种生物的ENc值均在50左右,差异并不大,说明其余6种生物的密码子偏好性要相对弱些。水稻、痢疾杆菌、柠檬酸杆菌、沙门氏菌、地衣芽孢杆菌和大肠杆菌这6种生物的gdh A基因在编码时偏好使用G或C结尾的密码子;玉米、大豆、蓖麻及拟南芥这4种生物的gdh A基因在编码时偏好使用A或T结尾的密码子。在10种生物中,密码子CUA、UAG的RSCU(relative synonymous codon usage)值均小于1,属于使用频率较低的密码子;其余各种密码子在不同生物中均表现出不同的偏好性。在聚类分析中,10种生物基于gdh A基因密码子用法与基于CDS序列的聚类结果大体一致。根据密码子分析的结果,对gdh A基因进行密码子优化,以期提高在大豆中的表达水平。     

西藏高原人群铁调素基因hamp密码子偏好性分析

目的:通过对西藏高原人群及平原人群、恒河猴等其他5种物种的密码子使用进行分析,从而得出西藏高原人群铁调素基因(hamp)的密码子偏好性。方法:采用PCR技术获得西藏高原人群铁调素全基因序列,利用在线软件CodonW进行密码子偏好性分析,通过在线软件PredictProtein以及Signal P等软件进行西藏高原人群铁调素基因的结构分析,比较与GenBank数据库中选取的平原人群、恒河猴等其他5种物种的密码子偏好性的差异。结果:西藏高原人群的铁调素基因全长为2681 bp,由3个外显子和2个内含子组成,编码84个氨基酸的铁调素前体肽,包含信号肽、中间肽与成熟肽,其密码子偏好性与平原人群、恒河猴等其他5个物种的密码子偏好性均有不同程度的差异。结论:西藏高原人群铁调素基因hamp密码子偏好性与其他物种的密码子偏好性均有不同程度的差异。     

同义密码子用语与蛋白质结构的关系

对大肠杆菌的５４种三维结构已知的蛋白质及其对应的ｍＲＮＡ序列的集合的分析结果表明,绝大部分密码子与其编码的氨基酸在蛋白质α螺旋、β折叠和卷曲等三种二级结构中的偏好性没有显著的统计性差异。同时,又对Ａｄｚｈｕｂｅｉ提供的相应哺乳类数据集作了同样的偏好性检验,表明９种氨基酸的同义密码子携带蛋白质二级结构信息,与他们的结论一致。推测,这种差异可能由翻译机制的进化趋异造成的。这些结果对于真核基因在原核生物中实现高表达可能有重要的实际意义。     

双歧番茄醋的实验研究

目的以番茄为主要原料,对双歧杆菌和醋酸杆菌共同发酵研制双歧番茄醋的工艺进行研究。方法通过正交试验筛选最适工艺。结果双歧番茄醋的最终醋酸度为27 g/L,含双歧杆菌总菌为1.9×1011CFU/mL,5 d内双歧杆菌活菌为5.5×107CFU/mL。双歧番茄醋棕黄色,光泽度好,有成熟番茄香味,入口酸甜适中。结论双歧杆菌与醋酸杆菌在可以番茄汁中共生,此方法制备双歧番茄醋可行。     

短短芽孢杆菌GZDF3全基因组密码子偏好性分析

为了解短短芽孢杆菌GZDF3全基因组密码子的使用特性,采用Codon W 1.4.2软件和Mobyle portal在线软件分析菌株GZDF3全基因组密码子偏好性,分析该菌的相对同义密码子使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)、密码子适应指数(codon adaption index,CAI)、有效密码子数(effective number of codon,Nc)、同义密码子第3位中G/C含量(GC3s)和高表达优越密码子。结果表明,短短芽孢杆菌GZDF3密码子第2位密码子的GC含量明显低于第1位和第3位,为37.56%,第1位和第3位的GC含量差异较小,分别为55.50%和51.13%;基因组大部分Nc值介于30~60,说明密码子偏好性普遍偏弱;RSCU值大于1的密码子共有27个,其中以A或T结尾的14个,占51.9%,并确定了27个最优密码子,为外源基因表达提供理论基础。     

用生料制备功能性双歧醋生产工艺的实验室研究

目的将双歧杆菌、醋酸菌、酵母菌和粉碎的制醋原料及麸曲共同发酵,通过生料制醋的方法来制备功能性双歧醋。方法将粉碎的玉米与麸曲、酵母液、麸皮和水搅拌均匀,使其经过液态糖化和酒精发酵后,接入醋酸菌和双歧杆菌(二者比例为1∶1),同时加入辅料,进行醋酸发酵,当检测到醋酸酸度为5.0%~7.5%时,加入食盐终止发酵,经过过滤,除菌澄清得到功能性双歧醋。结果双歧醋的最终醋酸度为3.2%,外观红棕色,光泽度好,清澈透明,无沉淀和悬浮物。总菌数:醋酸菌为3.3×1011/m l,双歧杆菌为1.9×107/m l;活菌数:醋酸菌为1.7×1011/m l,双歧杆菌为6.8×106/m l;大肠菌群数3个/100 m l;致病菌:不得检出。结论双歧杆菌及其代谢物可以在双歧醋中存活,生料固态发酵制备双歧醋的方法可行。     

对双歧杆菌DM9227株的实验研究——Ⅰ.双歧杆菌DM9227株的试管内生物拮抗作用的研究

本文对由健康婴儿分离的双歧杆菌DM9227株进行了试管内的生物拮抗试验。将双歧杆菌DM9227株分别与金黄色葡萄球菌、产毒性大肠杆菌及侵袭性大肠杆菌以一定的比例等量混合接种于PYG液体培养基中进行厌氧培养。试验证明双歧杆菌DM9227株能明显抑制上述3种细菌的生长繁殖,显示出较强的生物拮抗作用。拮抗机制可能与双歧杆菌DM9227株能产生一定量的醋酸和乳酸,降低培养基的pH,从而抑制该3种菌的生长有关。     

大肠杆菌基因中密码对使用的规律

为了探讨基因组序列的非随机性对密码对使用的影响程度,揭示依赖上下文的密码对偏爱性(CDCB)可能存在的规律,本文主要对大肠杆菌基因组中密码子及其紧邻密码子(密码对)偏爱作了全面的统计分析。结果发现85%的密码子在其紧邻密码子位点有显著依赖上下文的密码对偏爱性,通过密码对与全序列六联体(三联体对)的相对丰度比较发现,大约35%的密码对偏好性不能用基因组的序列组分来解释。当密码子第二和第三位点核苷酸相同,且紧邻密码子相同时,它们的相对丰度有显著相关性。结果表明我们的数据支持依赖上下文的密码子偏好的主要原因是蛋白质合成精确性选择的假设,即本文结果揭示了依赖上下文的密码对偏好性可能存在的规律,从而为今后进一步研究大肠杆菌基因组中密码对使用偏好性提供参考。     

嗜热毛壳菌基因组密码子偏好性研究

嗜热毛壳菌具有强大的木质纤维素降解能力,将其开发为优异的重组蛋白表达宿主有着广阔的应用前景。蛋白表达宿主的密码子偏好性对重组蛋白的表达水平具有重大影响。为确定嗜热毛壳菌中密码子的使用模式及影响因素,本研究以6 897条CDS序列为对象,对其进行密码子偏好性分析。结果显示,嗜热毛壳菌中GC3的平均含量为66.2%,高于GC1(59.1%)和GC2(45.6%)的平均含量。Effective number of codon(ENC)分析与中性绘图分析结果显示,自然选择是影响嗜热毛壳菌密码子偏好性的主要因素。相关性分析结果显示,芳香族氨基酸比例与GC1含量及蛋白疏水水平呈极显著相关,说明密码子第一位的碱基组成对氨基酸是否具有芳香性影响较大。此外,在嗜热毛壳菌使用频率较高的密码子中,有24个以G/C末端结尾的密码子,进一步确定了23个高表达优越密码子和1个高表达最优密码子(CGC)。通过与其他模式真菌的密码子偏好性进行比较发现：与嗜热毛壳菌在密码子使用频率上差异较小的为嗜热毁丝菌、粗糙脉孢霉,有显著差异的为酿酒酵母。本研究为在嗜热毛壳菌中异源表达重组蛋白提供了目标基因密码子优化的理论依据,为嗜...     

一种含双歧杆菌种属特异性复制子的新型大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒的构建

目前,双歧杆菌的转化是一个技术难题,与大肠杆菌等宿主菌的高转化效率不同,采用普通的原核质粒无法转化双歧杆菌.为此,本文提出双歧杆菌转化对质粒复制子具有"种属特异性"要求,并通过构建含有双歧杆菌特异复制子的新型穿梭质粒,以求解决这一难题.首先从GenBank获取长双歧杆菌隐性质粒pMB1的序列信息,采用Overlap-PCR方法获得其全长DNA,作为拟构建质粒的复制子;继而采用重组技术,将其与pMK4质粒片段(含大肠杆菌复制子pUC和抗氯霉素基因Cat)重组,构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒;用电穿孔法将重组质粒转化双歧杆菌,通过观察不同电转参数下的转化效率,选择双歧杆菌转化的最佳条件.结果,成功获得全长1899bp的pMB1复制子并构建成功含有pMB1和pUC双复制子的原核重组质粒,经酶切和测序鉴定正确,命名为pCMB1.以重组质粒成功转化了长双歧杆菌NCC2705和NQ1501,而其它3种野生型双歧杆菌(包括1株长双歧杆菌)未能转化成功.结论:质粒中含有双歧杆菌种属特异的复制子是实现双歧杆菌转化的必要条件;即使是含有特异复制子的质粒也只能转化有限数量种型甚至有限数量种株的双歧杆菌;选择最佳电转化条件能显著提高转化效率.     

大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体的构建及内皮抑素基因的表达

目的:构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体,并通过此载体使人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中得到表达。方法:以质粒pDG7、pBCSK( )、pET-9C为基础,构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128,并将人内皮抑素基因插入到新构建的表达载体中,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和长双歧杆菌NQ-1501。诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。结果:成功构建了大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体,人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中均可表达。结论:构建的穿梭载体为今后用双歧杆菌作为生理菌载体进行肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

皱边喉毛花及其近缘物种的叶绿体基因组结构与进化分析

为重建喉毛花属下系统发育关系,明晰属下皱边喉毛花及其近缘种之间的物种关系。本研究利用Illumina高通量测序平台对12 个叶绿体基因组进行双末端测序,获得大量高质量的Clean reads用于后续生物信息学分析。结果表明：（1）喉毛花属下物种的基因组差异较小,均在150 kb左右,基因总数为131 个,其中编码基因81 个。IR区核苷酸多态性比SC低,编码区比非编码区更保守。（2）进化分析结果显示,几乎所有的编码基因受到纯化选择的作用。（3）密码子偏好性分析表明有35 个密码子的RSCU值均大于1,说明使用这些密码子的频率较高,各项密码子偏好性衡量指标说明喉毛花属物种的密码子偏好性较弱。（4）系统发育分析表明CDS、密码子位置与基因间隔区数据集构建的系统发育树具有高度一致的拓扑结构,大部分分支的支持率高。这些结果表明皱边喉毛花及其近缘种的叶绿体基因组无明显差异,在系统发育树上无法按物种聚类,也为后续展开喉毛花属下群体遗传学研究提供科学依据。     

大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭载体的构建及PTEN在长双歧杆菌中的表达

长双歧杆菌可特异地定植于实体瘤低氧区,可用做肿瘤靶向性基因治疗的载体,而构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭质粒则被证明是外源基因在长双歧杆菌中稳定表达的有效途径。为了构建能在长双歧杆菌中稳定表达外源基因的穿梭质粒并检测携带抑癌基因的工程菌对小鼠实体瘤的抑制效果,利用软件设计并合成了48条部分序列相互重叠的引物,通过PCR合成了长双歧杆菌质粒pMB1序列及长双歧杆菌HU启动子区序列,插入克隆载体pMD18-T,构建穿梭载体pMB-HU,该载体可在大肠杆菌DH5α及长双歧杆菌L17中稳定复制。PTEN基因编码具有蛋白质和酯类双重特异性磷酸酶活性的抑癌因子。将PTEN基因cDNA序列插入载体pMB-HU中HU启动子下游,构建重组质粒pMB-HU-PTEN,电击转化长双歧杆菌后,Western blot检测表明,表达产物中存在55kDa的PTEN蛋白特异条带。抑癌试验表明:与对照组相比,携带PTEN基因的长双歧杆菌可显著抑制小鼠实体瘤的生长。上述结果为以长双歧杆菌为载体的实体瘤靶向性基因治疗研究奠定了基础。     

试管内双歧杆菌、复方双歧杆菌制剂对肠道致病菌的拮抗作用

试管内,两歧双歧杆菌(6-1)株对福氏志贺氏痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌都具有一定的拮抗作用。复方双歧杆菌制剂对福氏志贺氏痢疾杆菌具有很强的拮抗作用,甚至能完全抑制其生长繁殖。提示,在抑制肠道致病菌方面,复方双歧杆菌制剂要比单一的双歧杆菌具备更强的效能和更多的优越性。     

耐氧双歧杆菌rDNA ISR序列测定及特征分析

目的 对4种耐氧双歧杆菌16S-23S rDNA ISR序列进行克隆和序列分析。方法采用凝胶分离PCR产物的方法。结果长双歧杆菌和短双歧杆菌16S-23S rDNA ISR序列一致,全长568个碱基对;青春双歧杆菌与婴儿双歧杆菌序列一致,全长510个碱基对。通过19种双歧杆菌和4种耐氧双歧杆菌ISR序列分析表明,该序列中含有一个保守的特征序列,可作为双歧杆菌属的分子标记,此外还含有3个基因高变区,可用双歧杆菌种间分子鉴定的基础。结论对23种双歧杆菌聚类分析表明,耐氧双歧杆菌ISR序列已发生改变,为进一步研究双歧杆菌在有氧条件下进化机制奠定了基础。     

鲤肠道正常菌群的研究

本实验用稀释滴种的定量方法,对淡水养殖地中健康鲤肠道内的１０种菌群进行了定性、定量分析,并对结果进行统计学处理,得到鲤肠菌群的一些生理值。结果表明鲤肠道中需氧、兼性厌氧优势菌是气单胞菌和酵母菌,厌氧优势菌是拟杆菌。对不同时间、不同温度条件下同一养殖池中鲤肠道菌群的测定结果比较表明：葡萄球菌、假单胞菌差异显著（ｐ＜０．０５）,气单胞菌、大肠杆菌、需氧芽胞杆菌、酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、梭状芽胞杆菌差异不显著（ｐ＞０．０５）,表明该８种菌群在鲤肠道中的菌数处于相对稳定状态,属于肠道正常菌群。     

H5N2亚型禽流感病毒血凝素裂解位点碱性氨基酸对应mRNA核苷酸的二级结构分析

以H5N2亚型禽流感病毒毒株血凝素蛋白裂解位点碱性氨基酸为研究对象,对其密码子偏好性和对应mRNA序列的折叠二级结构特点进行研究和分析。旨在探讨裂解位点氨基酸对应mRNA核苷酸片段的二级结构与病毒致病力的关系,希望能对禽流感病毒的研究提供一些基础性信息。将mRNA样本按照序列等步长递增的方法,用RNAstructure 4．1程序预测这些样本的动态延伸折叠二级结构。序列和结构的分析结果：裂解位点的碱性氨基酸对富含腺嘌呤的密码子有强烈偏好;与碱性氨基酸对应的mRNA片段上的核苷酸主要位于折叠二级结构的单链环区,少数位于配对螺旋区。结果表明：裂解位点氨基酸对应的mRNA核苷酸形成发夹端环的大小与其碱性氨基酸的多少具有正相关性。     

人生长素基因的合成及克隆

根据人生长素基因的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏好的密码子,人工设计并合成了20个寡核苷酸片断。通过重叠区扩增法,利用PCR成功地合成了人生长激素基因的全序列。经克隆测序,证明已成功地实现了人生长素基因的合成及克隆。