Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的转基因小鼠。方法:用分子克隆的方法构建包括肺表面活性蛋白A(SP-A)启动子、SARS-CoVN蛋白基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和人生长激素(hGH)polyA的转基因载体pSP-A-N。以显微注射的方法将8.3kb的转基因片段引入小鼠受精卵。通过PCR、Southern印迹和LacZ染色检测子代小鼠中转基因的整合及表达。结果:共注射952枚受精卵,移植至42只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠128只,经PCR、Southern印迹鉴定,其中11只小鼠基因组上整合有SARS-CoVN蛋白基因,整合率为8.6%。鉴定结果显示,11只转基因首建者小鼠中有1只表达外源基因并能正常传代。LacZ染色结果表明N蛋白基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中特异表达。结论:成功构建了Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS-CoVN蛋白的转基因小鼠,为深入研究该基因的病理生理学效应奠定了基础。     

中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠

利用从129sv小鼠基因组文库克隆得到的1．8kb的胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)基因的5′端调控序列,构建了含有2个β—珠蛋白绝缘子、GFAP5′端调控区、Cre基因和人生长激素基因(hGH)polyA的转基因载体pGFAP—Cre—hGH。以显微注射的方法将7．6kb的转基因片段pGFAP—Cre—hGH引入191枚小鼠基因组受精卵,其中176枚分别移植至8只假孕母鼠的输卵管中使其发育,共获得子代小鼠25只。经PCR和Southern杂交鉴定其中7只小鼠基因组上整合有Cre基因,整合率为28％。用整合有Cre基因的转基因小鼠与基因组上整合有LoxP位点和LacZ表达框的ROSA26鼠杂交,以检测Cre酶的活性、组织特异性及其介导的两个LoxP位点间的重组。LacZ染色结果表明,GFAP—Cre转基因小鼠只在中枢神经系统中表达Cre重组酶并能在体内成功介导LoxP位点间的重组。     

嵌合基因δKρF在转基因小鼠内的组织特异性表达

本文报告了鸡δ晶体蛋白基因的启动子,被Friend脾病灶形成病毒(SFFV)的长末端重复顺序(LTR)取代后的嵌合基因δKpF在转基因小鼠内的表达特性。采用显微注射方法,将含有δKpF基因的重组质粒pδKpF DNA导入小鼠受精卵的雄原核,再将其植入假孕小鼠的输卵管内,经生长发育,产出小鼠35只。以DNA-DNA分子杂交分析,发现其中1只小鼠的基因组DNA中整合有所导入的δKpE基因。再以免疫酶标记方法检测,发现δKpF基因在转基因小鼠内能够表达,而且具有组织特异性。作者认为,与δ晶体蛋白基因组织特异性表达有关的调节顺序位于+677bp之后。这与Hayashi等(1985)以培养细胞研究的结论不一致。     

三种丙型肝炎病毒转基因小鼠系的同时制备

为研究丙型肝炎病毒的致病致瘤机理及结构基因与非结构基因3区(NS3)的功能及其在HCV感染致病中的作用,建立一个HCV分子治疗的动物模型,构建了含金属硫蛋白启动子和HCV结构基因或NS3基因的质粒,将两者等量混合后用显微注射法接种于昆明白小鼠受精卵内制备转基因小鼠.通过PCR筛选获得三种整合HCV结构基因或/和NS3基因的首建鼠.结果表明:a.注射后卵存活率与仔鼠出生率分别为81%、30%;b.检测60只G0代小鼠,结构基因整合鼠6只(10%),NS3基因整合鼠4只(6.7%),双基因整合鼠9只(15%),总整合率为31.7%;c.RT-PCR法检测阳性鼠肝中有靶基因mRNA的转录;d.4只首建鼠与正常鼠回交获得38只G1小鼠,其中20只为整合鼠,整合率为52.6%;e.转基因鼠表型迄今无明显异常.表明一次显微注射同时获得了三种整合HCV结构基因或/和NS3基因的转基因小鼠.     

人ApoE转基因小鼠与TGE_（7－2） TGE_（7－3）转基因鼠系的建立

用含小鼠金属硫蛋白（ＭＴ－１）基因启动子与突变的人ＡｐｏＥ７基因的６．０ＫｂＤＮＡ片段作为目的基因制备转基因小鼠,利用显微注射法将目的基因导入４４１枚受精卵,移植于２０只假孕鼠,其中１５只受孕,共产仔鼠８０只,经ａ－３２Ｐ斑点杂交与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交法鉴定出两只整合有人ＡｐｏＥ基因的转基因雌鼠,其拷贝数分别为２和５。将两只首建鼠（雌性Ｆｏ代）与正常雄鼠交配,建立Ｆ１代转基因鼠系ＴＧＥ７－２和ＴＧＥ７－３,为进一步从整体上研究ＡｐｏＥ在脂质代谢中的作用以及ＡｐｏＥ与动脉粥样硬化和Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ病的关系创造条件。     

人DAF基因在转基因小鼠中的遗传与表达

为研究人ＤＡＦ基因在小鼠体内遗传与表达的规律,从质粒ｐＳＦＦＶ－ＤＡＦ分离出一段包含人ＤＡＦ基因的ＤＮＡ片段。采用受精卵显微注射法建立转人ＤＡＦ基因小鼠。提取出生小鼠的染色体ＤＮＡ,经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交相结合确定首建转基因小鼠,并经Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ杂交研究人ＤＡＦ基因在转基因小鼠体内的遗传特征,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交确定其表达情况。小鼠受精卵经基因导入后,共生出２４只小鼠,其中４只被确定为首建转基因小鼠,整合率为１５％,在首建转基因小鼠两两交配生出的Ｆ１代小鼠中分别有７０％和７５％继续携带人ＤＡＦ基因。首建转基因小鼠中有１只小鼠在ＲＮＡ水平表达了人ＤＡＦ基因。可见,人ＤＡＦ基因整合入小鼠基因组中,并能够稳定遗传及表达。     

人β_2m转基因小鼠的制备及鉴定(英文)

制备人 β2m转基因小鼠 ,研究HLA B2 70 4基因的表达 .应用显微注射将人 β2m基因注入C5 7BL 6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 .出生动物及其后代经PCR筛选 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本进行进一步鉴定和测定整合拷贝数 ,利用RT PCR检测阳性鼠中人 β2m转基因的表达 .6只原代仔鼠及 7只它们的下一代鼠 (F1)带有人 β2m基因 .由微注射基因后移卵出生的 86只小鼠中 ,C5 7BL 6×昆明鼠杂交仔鼠 35只 ,其中 4只阳性 (11 4 % ) ,昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠 5 1只 ,其中 2只阳性 (3 9% ) ,含有人 β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠 2 0只 ,其中 7只阳性 .整合的转基因均为单拷贝 .Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达 .在转基因动物制备中 ,C5 7BL 6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代 .与人HLA B2 70 4基因相比 ,人 β2m基因不易整合 ,其整合率与整合拷贝数均较低 .得到的人 β2m转基因小鼠能够将人 β2m基困传给下一代 ,并可与人HLA B2 70 4转基因鼠交配 ,研究它的致病性     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型,并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法,把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠,经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

人β_2m转基因小鼠的制备及鉴定(英文)

 制备人 β2m转基因小鼠 ,研究HLA B2 70 4基因的表达 .应用显微注射将人 β2m基因注入C5 7BL 6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 .出生动物及其后代经PCR筛选 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本进行进一步鉴定和测定整合拷贝数 ,利用RT PCR检测阳性鼠中人 β2m转基因的表达 .6只原代仔鼠及 7只它们的下一代鼠 (F1)带有人 β2m基因 .由微注射基因后移卵出生的 86只小鼠中 ,C5 7BL 6×昆明鼠杂交仔鼠 35只 ,其中 4只阳性 (11 4 % ) ,昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠 5 1只 ,其中 2只阳性 (3 9% ) ,含有人 β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠 2 0只 ,其中 7只阳性 .整合的转基因均为单拷贝 .Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达 .在转基因动物制备中 ,C5 7BL 6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代 .与人HLA B2 70 4基因相比 ,人 β2m基因不易整合 ,其整合率与整合拷贝数均较低 .得到的人 β2m转基因小鼠能够将人 β2m基困传给下一代 ,并可与人HLA B2 70 4转基因鼠交配 ,研究它的致病性     

HBx、ras基因的克隆及精原细胞转染法制备转基因小鼠的初步研究

目的:探索以精原细胞转染法制备乙肝病毒HBx基因及突变ras基因的转基因小鼠的可行性.方法:首先构建携带HBx基因和突变ras基因的真核表达载体pcDNA3.1-HBx及pEGFP-N1-Kras.将上述两种重组载体混合后,用脂质体包被,用注入4只雄性小鼠之睾丸组织中.注射后4周,使上述处理过的雄性小鼠与雌性小鼠合笼交配.小鼠出生后2～4周,剪其尾尖,并以多聚酶链式反应(PCR)对基因整合进行鉴定.结果:共产仔小鼠35只,3只仔小鼠PCR阳性(阳性率8.6%).其中,两只HBx基因阳性,1只HBx、ras基因均为阳性.结论:以精原细胞作为栽体,建立带HBx及ms基因的小鼠模型是可行的,为建立树鼩转基因动物模型的研究打下基础.     

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配,共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中,有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。     

体内精原干细胞转染法建立转基因小鼠

将人Bcl-2 cDNA与小鼠乳清酸蛋白(WAP)5’上游调控序列融合后,与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了3只公鼠,4天后将公鼠与发情母鼠合笼交配。共生仔鼠20只。检测结果表明,有3只呈PCR阳性,Southern blot检测,阳性鼠2只,1只公鼠,1只母鼠,其中,公鼠意外死亡;Western blot证实,1只母鼠的乳腺组织表达了Bcl-2蛋白,其F1代的16只小鼠中。有7只呈PCR阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。     

Analysis of adeno-associated virus-mediated ex vivo transferred human β-globin gene in bone marrow engrafted mice

Adeno-associated virus (AAV)-2 was developed as a useful vector for human gene therapy. In this report, we analyzed the integration and expression of AAV-mediated ex vivo transferred human beta-globin gene in bone marrow (BM) reconstituted mice. Recombinant AAV (rAAV) containing human beta-globin gene was packaged by infecting individual G418-resistant BHK-21 cell clones integrated with the plasmid AV53HS432Deltabeta2.0Neo with recombinant herpes simplex virus, which can express rep and cap genes of wild-type AAV. The titer of rAAV was determined using slot blot hybridization with a result of 10(13) virus particles/ml (genome copy number). Low-density mononuclear cells were isolated from fetal livers of embryos from pregnant C57BL/6 mice at 14-16 days of gestation and were infected with rAAV. The transduced hematopoietic cells were then reinfused into lethally irradiated C57BL/6 recipient mice via tail vein injection. To analyze the provirus in short-term and long-term BM reconstituted mice, PCR/Southern blot and RT-PCR were performed to identify the integrity of the provirus and to detect the expression of human beta-globin gene, respectively. Genomic DNA was extracted from spleen nodules of BM reconstituted mice 12 days after transplantation. Human beta-globin gene was detected in 1 out of 6 nodules using PCR combined with Southern blot. Human beta-globin gene was also detected in the BM and thymus of mouse Y6161, in the thymus and spleen of mouse Y6162 and in the BM of mice Y6211 and Y6212. RT-PCR revealed low levels of expression of human beta-globin gene in the BM of mouse Y6211. Our results suggested that the efficiency of AAV-mediated human beta-globin gene integration into hematopoietic stem/progenitor cells was very low. It is necessary to perform further research on AAV biology before applying gene therapy that requires integration of a foreign gene into host chromosomes.     

转hDAF基因小鼠的构建(英文)

本工作构建了含有ｈＤＡＦ基因的转基因小鼠,以便研究ｈＤＡＦ基因能否消除异种器官移植中的排斥反应。 采用ＤＮＡ重组的方法构建ｈＤＡＦ基因的表达载体ｐＳＰ６４ＨＰ（Ｆｉｇ．１）。通过受精卵显微注射,将其中的目的基因片段,转移到小鼠体内,建立转基因小鼠。再通过Ｄｏｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ杂交方法对出生小鼠的基因组特征进行查证。 连续两次对直接裂解菌液做ＰＣＲ扩增,筛选出重组质粒（Ｆｉｇ．２＆３）,酶切图谱（Ｆｉｇ．４）和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（Ｆｉｇ．５）分析结果与预期吻合,出现预期条带;小鼠受精卵注射后存活比率为７７．９％,受精卵的发育率为３．４％,出生小鼠中,１０．５％出现清晰杂交信号。 表明：ｈＤＡＦ基因表达载体构建成功;并整合入小鼠基因组中。     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。     

Dicer1转基因小鼠模型的建立

目的建立Dicer1转基因小鼠模型。方法构建pcDNA3.1-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基因表达。结果显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern检测6只均为阳性。对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础。     

Production of transgenic mice carrying the human hepatitis B virus or the human papillomavirus DNA sequences in Taiwan: analysis of physical structure and hereditary mode

In order to produce suitable animal model systems for the analysis of possible synergistic interaction between hepatitis B virus (HBV) or the human papillomavirus (HPV) with other viral or chemical co-factors, we have produced transgenic mice carrying HBV, HPV16 or HPV18. Transfer of 3343 micro-injected one-cell (C57/BL6 X CBA) F1 embryos into pseudo-pregnant ICR recipients produced 181 pups. Seventeen of 151 of the pups analysed were found to be transgenics. Southern blot and slot blot analysis showed that the copy number of the transgenome in the transgenic mice ranged from 1-50 copies per cell. All the transgenomes analysed appeared to be in tandem repeats without detectable sequence rearrangements. The transgenome sequences were also stable on transmission to the F3 generation. On breeding, six of the ten transgenic mice analysed showed the Mendelian mode of inheritance with integration at single or multiple loci. Of the remaining four mice, three were mosaics and one was sterile. Analysis of the gene expression of the transgenic mice is currently in progress.     

农杆菌介导的玉米遗传转化

用带有质粒pGIH(35S-intron-GUS/ Hptr)的根癌农杆菌EHA101转化玉米愈伤组织,获得潮霉素抗性植株,再生性好的苏玉1 图7 Southern blot分析HpaII消化的质粒pGIH 和gusA基因沉默的愈伤组织的总DNA Fig.7 Southern blot analysis of plasmid pGIH(P) and plant genomic DNA of gusA gene si- lence callus(T)digested with HpaII号转化率可以达到8.1%。对转化植株进行GUS染色分析及PCR和Southern杂交检测证明外源基因已经整合,并能够稳定表达。反向PCR分析的三个转化植株,T-DNA插入片段均为单拷贝。部分失去分化能力的抗性愈伤组织,Southern blot分析发现其基因组中有gusA基因插入,但X-gluc染色呈阴性,经HpaII酶切分析发现整合的gusA基因发生了高度甲基化。     

5-脂氧化酶转基因小鼠模型的制备

目的建立5-脂氧化酶(5-LO)转基因小鼠进行动脉粥样硬化的发病分子机制的研究。方法通过显微注射的方法,将5-脂氧化酶基因片段(6.8 kb)导入BDF1受精卵雄原核并移植到同期受孕的假孕母鼠输卵管中,对产出仔鼠的鼠尾组织DNA进行PCR、Southern blot检测,对9、20、24号转基因小鼠分别提取腹腔细胞、骨髓细胞及脾、肾组织总RNA和蛋白,并采用RT-PCR、Western blot方法进行转录水平检测和蛋白表达检测。结果共产生25只子代小鼠,经PCR和Southern检测获得7只阳性小鼠,经RT-PCR和Western blot检测结果表明,9、20、24号转基因小鼠腹腔细胞、骨髓细胞、脾、肾5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白(FLAP)在RNA和蛋白水平表达均高于正常BDF1对照小鼠,且统计学分析腹腔细胞、骨髓细胞表达均具有显著差异(P0.05)。结论成功建立5-LO转基因小鼠模型。     

Microdissection of human chromosomal regions 8q23.3-q24.11 and 2q33-qter: construction of DNA libraries and isolation of their clones.

Human chromosomal regions 8q23.3-q24.11 and 2q33-qter were microdissected, DNAs from the regions were amplified with the primer-linker method of polymerase chain reaction (PCR), and their DNA libraries were constructed by cloning into pUC19. The primer-linker PCR involved Sau3AI digestion of microdissected chromosomal DNAs, ligation of the digests to a 10mer DNA linker and 24mer primer, filling the recessed 3' ends, and PCR amplification using the 24mer DNA as a primer. A total of 3.5 x 10(4) pUC19 recombinants (8q library) from the 8q region and 5.0 x 10(4) pUC clones (2q library) from the 2q region were obtained. From the 8q library, 60 pUC clones were selected, while 88 pUC-clones were selected from the 2q library. These clones were Southern blot analyzed on hybrid cell panels with or without human chromosome 8 or 2. Twelve (20%) of the 60 8q-derived clones were unique DNA sequences, and 9 were subjected to deletion analysis in the genomic DNA of two patients, one with trichorhino-phalangeal syndrome (TRPS) type I and the other with TRPS type II, both with del(8) (q23.3q24.13). Five of the 9 pUC clones tested showed a one-copy density in both patients, an indication that the clones map to the region deleted in both patients. Screening a genomic DNA library constructed in the phage revealed a clone with a 9.4-kb insert and a one-copy density in both patients. From the 2q library, 15 (17%) of the 88 pUC clones obtained were unique sequences. When a phage library was screened, 8 clones were obtained: 4 were identical and 2 were overlapping sequences.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)