潮霉素抗性3T3细胞的建立和鉴定

目的　建立具有潮霉素 (hygromycin)抗性的 3T3细胞系 ,用于转染目的基因 (pTRE Ins human)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pHyg导入 3T3细胞中 ,利用潮霉素的药物选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行PCR鉴定。结果　经 5 0 0 μg ml的潮霉素压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性 3T3细胞的形态和生长速度与正常 3T3细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了潮霉素抗性的 3T3细胞 ,为进行目的基因 (pTRE Ins human)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础。     

启动子CMV和EF1α对人胰岛素基因在BHK细胞中表达的影响

目的　构建人胰岛素基因真核高效表达载体 ,为胰岛素转基因研究奠定基础。方法　用限制性内切酶SpeⅠ和HindⅢ消化pEF1α GFP ,回收 1 2kbEF1α启动子 ,插入到pCMV mINS的NruⅠ和HindⅢ位点中 ,获得重组质粒pEF1α mINS ;将pCMV mINS和pEF1α mINS分别转染BHK细胞 ,用G418筛选 ,阳性克隆传至 2 0代后 ,分别用放免方法和免疫组化法分析胰岛素和 或胰岛素原在BHK细胞中的表达情况。结果　经放免测定 ,pCMV mINS和pEF1α mINS在BHK细胞中胰岛素和 或胰岛素原的表达量分别为 4 0 77μIU ml和 6 897μIU ml。经免疫组化分析 ,pCMV mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 190 0± 19 5 6 ;pEF1α mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 181 4± 18 45 ,在BHK细胞核中表达水平的灰度值为 15 5 4± 11 6 6。结论　在BHK细胞中启动子EF1α启动胰岛素基因表达的活性比启动子CMV高。     

分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素

目的　研究不同培养条件分离和克隆小鼠ES细胞集落的效率。方法　以PMEF饲养层、NIH3T3细胞饲养层或培养液中加入LIF为培养条件 ,分离和克隆昆明小鼠ES细胞集落 ,比较其效率。结果　饲养层的培养条件明显优于培养液中加入LIF的培养条件 ;有饲养层的培养条件下 ,桑椹胚的ES细胞集落出现率显著低于囊胚 ;两种饲养层培养囊胚 ,其ES细胞集落的出现率差异无显著性。结论　以PMEF或NIH3T3细胞作饲养层 ,培养昆明小鼠的囊胚 ,适时离散ICM ,是比较理想的分离ES细胞集落的方法。     

胚胎冷冻技术应用于抗菌肽转基因小鼠的保种传代

目的研究胚胎冷冻在抗菌肽转基因FVB小鼠保种传代中的应用。方法对6~8周正常雌性FVB小鼠进行超排分别与雄性杂合子抗菌肽转基因FVB小鼠交配,收集2-cell胚胎,进行胚胎冷冻。1周后进行胚胎复苏移植,通过PCR方法对仔代鉴定。结果冻存胚胎140枚,复苏获得存活胚胎98枚,移植85枚,产仔38只,获得阳性后代12只。结论通过胚胎冷冻技术保种及复苏移植技术可对抗菌肽转基因小鼠进行传代。     

STK15转基因小鼠模型的建立

STK15基因是丝/苏氨酸激酶家族成员之一,其扩增和高表达能引起中心体复制扩增,染色体不稳定性增加,最终导致细胞的恶性转化,从而诱发恶性肿瘤。而且,STK15基因在多种恶性肿瘤组织中都具有高表达。目前,研究者们都是通过取人体不同部位的肿瘤组织来研究STK15基因与恶性肿瘤发生发展的关系,本次实验首次以建立STK15转基因小鼠模型,来进一步研究STK15基因与恶性肿瘤的关系,为今后的基因诊治提供理论基础。实验方法是首先提取人胚肺细胞总RNA作为模版,根据GenBank中STK15基因序列设计一对引物,用RT-PCR技术扩增出1200bp的STK15基因片段,克隆到pTZ57R/T载体,通过测序证实序列的正确性。用BamH1和XbaI双酶切载体pcDNA3.1和pTZ57R/T载体-STK15,然后回收、连接pcDNA3.1-STK15、转化、鉴定,从而成功构建了pcDNA3.1-STK15表达载体。然后对小鼠进行超排获得其原核期胚胎,应用显微注射法进行转基因操作,结果是注射成功率77%（701/907）,移植鼠共30只,新生小鼠为106只,PCR检测转基因阳性为3只,经过Southern杂交检测有1只转基因阳性鼠,从而建立了转STK15的转基因小鼠模型。通过建立STK15肿瘤动物模型,找出与人类肿瘤相近的病理生理变化以及控制这些变化的遗传基础,为今后所有的恶性肿瘤的基因诊治提供坚实、有力的理论依据。     

具潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备

[目的]建立具有潮霉素B(hygromycinB)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2-human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。[方法]通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和southernblot鉴定。[结果]经300ug/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。[结论]本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

RNA干扰技术在基因治疗中的应用进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种双链RNA分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程,在基因治疗方面有着无可比拟的优势,已成功的应用于肿瘤、病毒感染、遗传性疾病及神经系统疾病等重大疾病的治疗.本文将主要介绍siRNA基因治疗的导入方法与途径,以及在不同疾病中,RNAi技术进行基因治疗的应用.     

5-脂氧化酶转基因小鼠模型的制备

目的建立5-脂氧化酶(5-LO)转基因小鼠进行动脉粥样硬化的发病分子机制的研究。方法通过显微注射的方法,将5-脂氧化酶基因片段(6.8 kb)导入BDF1受精卵雄原核并移植到同期受孕的假孕母鼠输卵管中,对产出仔鼠的鼠尾组织DNA进行PCR、Southern blot检测,对9、20、24号转基因小鼠分别提取腹腔细胞、骨髓细胞及脾、肾组织总RNA和蛋白,并采用RT-PCR、Western blot方法进行转录水平检测和蛋白表达检测。结果共产生25只子代小鼠,经PCR和Southern检测获得7只阳性小鼠,经RT-PCR和Western blot检测结果表明,9、20、24号转基因小鼠腹腔细胞、骨髓细胞、脾、肾5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白(FLAP)在RNA和蛋白水平表达均高于正常BDF1对照小鼠,且统计学分析腹腔细胞、骨髓细胞表达均具有显著差异(P0.05)。结论成功建立5-LO转基因小鼠模型。     

潮霉素抗性转基因BDF1小鼠模型的建立

目的建立具有潮霉素（hygromycin）抗性转基因BDF1小鼠,用于制备携有hygromycin抗性筛选标志ES阳性细胞克隆的饲养层。方法通过显微注射的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因片段（5.1kb）导入BDF1受精卵雄原核中,共注射169枚受精卵,然后将129枚受精卵细胞植入同期受孕的受体母鼠输卵管内。结果共产生37只转基因小鼠,经PCR和Southern检测获得9只阳性小鼠,对一只子代鼠进行RT-PCR检测证明hyg基因已经在肾、肌肉、脾内表达。结论成功的建立具有潮霉素抗性的BDF1转基因鼠,该模型动物可以为基因敲除研究提供良好的基础条件。     

G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

通过脂质体转染的方法,先后将含有neo基因的质粒pWL／neo和含有潮霉素基因的质粒导入NIH3T3细胞中,利用G418和潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,经500μg／ml的G418和300μg／ml潮霉素B压力筛选后,获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,用PCR法特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征,成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞,为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。