激肽释放酶转基因大鼠模型的建立

目的建立KLK1转基因大鼠模型。方法腹腔注射PMSG-HCG（150-150IU/kg）超排不同周龄（4-8周）SD大鼠比较超排效果的差异,以可用于注射胚胎数作为评判标准确定最佳超排周龄。构建pBC-klk1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入SD大鼠受精卵原核并移植到同期受孕的SD受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过RT-PCR和免疫组化方法检测klk1基因表达。结果4-8周SD大鼠超排后分别获得受精卵14±14.8、30±15.2、13.3±13.7、13±14.7、8±5.7,5周龄大鼠超排效果最好,与其他周龄大鼠相比有显差异,P〈0.05;显微注射1538枚卵,移植685（44.53%）枚卵于31只受体输卵管中,12（12/31,38.7%）只怀孕,共产仔62只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern检测3只阳性。对Southern检测阳性转基因大鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明klk1基因在肾脏、胰腺和乳腺内表达。结论成功建立klk1基因表达的转基因大鼠模型,该模型是高血压病研究的理想动物模型。     

TNNT3~（R69H）突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-TNNT3（R69H）转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3（R69H）注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达。结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠。对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3（R69H）在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3（R69H）突变转基因小鼠模型。     

四环素调控SV40Tag转基因小鼠模型的建立

目的构建四环素调控的SV40T转基因小鼠模型。方法同时显微注射外源基因p205-rtTA-C3和pTRE-Tag至FVB小鼠原核,注射受精卵移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。结果经PCR结合Southern检测得到rtTA和Tag双阳性转基因小鼠一只,rtTA单阳性两只和Tag单阳性一只。结论通过饮水给与四环素的双阳性小鼠可在卵巢中检测到Tag mRNA的表达。     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTAl外源基因整合到C57BL／6J小鼠中,构建稳定高表达MTAl的小鼠模型。方法通过RT—PCR方法克隆人的MTAl编码序列,将MTAl插入真核表达载体pcDNA3．1构建pcDNA3．1-MTAl载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTAl特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western—blot及免疫组化方法检测MTAl在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTAl转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100％,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTAl基因,整合率为11．25％。经PCR鉴定MTAl整合阳性的F1代小鼠,再经Western—blot和免疫组化分析检测MTAl表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTAl的转基因小鼠,为进一步MTAl研究奠定了良好的研究模型。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型,并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法,把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠,经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

潮霉素抗性转基因BDF1小鼠模型的建立

目的建立具有潮霉素（hygromycin）抗性转基因BDF1小鼠,用于制备携有hygromycin抗性筛选标志ES阳性细胞克隆的饲养层。方法通过显微注射的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因片段（5.1kb）导入BDF1受精卵雄原核中,共注射169枚受精卵,然后将129枚受精卵细胞植入同期受孕的受体母鼠输卵管内。结果共产生37只转基因小鼠,经PCR和Southern检测获得9只阳性小鼠,对一只子代鼠进行RT-PCR检测证明hyg基因已经在肾、肌肉、脾内表达。结论成功的建立具有潮霉素抗性的BDF1转基因鼠,该模型动物可以为基因敲除研究提供良好的基础条件。     

绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表达

建立绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,继而传代建系。采用显微注射法,将GFP基因注入FVB／NJ小鼠受精卵原核内,获得子代鼠。分娩后3周剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southern印迹技术进行整合检测。结共用雌性小鼠200只,注射受精卵1586枚,移植卵数386枚,受体鼠32只,怀孕鼠4只,子代鼠18只,有4只为阳性：取2只首建鼠的胚胎,在荧光显微镜下观察GFP表达明显,表明初步获得了转绿色荧光蛋白基因小鼠,     

HLA-Ⅱ类基因DRα及DRB_1~*0401~1转基因小鼠的制备

利用受精卵原核的显微注射技术 ,将人类HLA Ⅱ类DRα及DRB1 0 4 0 1两种基因 ,显微注射至C5 7BL 6×DBA 1杂交小鼠受精卵中 ;并移植至假孕受体鼠的输卵管内。实验先后有 8只鼠妊娠 ,稳定遗传五代 ,经PCR检测 95只HLA DRα、DRB1 0 4 0 1阳性。α 32P dCTP斑点杂交与Southern印迹杂交鉴定出 6 8只整合含有DRα及DRB1 0 4 0 1混合型的转基因小鼠 ,有效率为 2 0 .9%。经Northern杂交[1] 和RT PCR检测 ,其HLA DRα、DRB1 0 4 0 1基因在脾脏和肾脏中均有表达。结果说明 ,携带人类HLA Ⅱ类DRα和DRB1 0 4 0 1基因的转基因动物模型构建成功。     

血红素加氧酶-1显性负性突变体转基因小鼠模型的建立与鉴定

目的建立血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)显性负性突变体G143H转基因小鼠模型。方法通过SalI/DraI酶切pCAGGHO-1G143H转基因表达载体,纯化回收HO-1G143H表达盒片段;通过显微注射把表达目的基因的DNA片段导入FVB小鼠受精卵原核,并移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠;用PCR对子代鼠尾DNA进行鉴定,并用Southern blot对结果做进一步验证;通过RT-PCR、免疫组化和Western blot方法检测HO-1基因的表达。结果表达盒回收片段正确;假孕鼠出生的17只子代小鼠共有3只阳性,均为雄性;RT-PCR、免疫组化和Western blot结果表明,阳性小鼠体内的HO-1 mRNA与蛋白表达水平增高。结论成功建立HO-1显性负性突变体G143H表达的转基因小鼠,该模型为研究HO-1在体内的作用机制奠定了基础。     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的：将人的钙蛋白酶抑制蛋白（ calpastatin, CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法利用Gateway技术构建pRP．EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57 BL/6 J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100％,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9％。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

嗜铬颗粒蛋白A基因的反义转基因小鼠模型的建立及该基因启动子的组织特异性

构建小鼠嗜铬颗粒蛋白A（Chromogranin,A,CGA)基因的反义DNA载体pGAS1C－lacZ。用电穿孔的方法将该载体转化大鼠肾上腺髓质细胞瘤细胞系PC－12,X－Gal染色后证明位于CGA基因启动子下游的报告基因lacX已经表达。用限制性内切酶除去载体的质粒骨架后,显微注射入供体昆明小鼠的受精卵中,随后将注射过DNA的受精卵移植入假母的输卵管中,完成正常的胚胎发育。用PCR的方法筛选假母产下的小鼠,得到CGA基因反义RNA基因首建鼠14只。将首建鼠分别与正常昆明鼠交配,产生后代。取首建鼠的肾上腺进行X－Gal染色,组织用于石蜡切片,根据各鼠肾上腺切片的蓝色深浅判定转入基因量的高低,筛选到两只表达量高的首建鼠,留下它们的后代。取转基因鼠的各种组织用于X－Gal染色,发现报告基因在肾上腺、胰腺的胰岛中有表达,而在肌肉、脂肪组织中无表达,说明CGA基因的启动子具有神经内分泌组织特异性。     

5-脂氧化酶转基因小鼠模型的制备

目的建立5-脂氧化酶(5-LO)转基因小鼠进行动脉粥样硬化的发病分子机制的研究。方法通过显微注射的方法,将5-脂氧化酶基因片段(6.8 kb)导入BDF1受精卵雄原核并移植到同期受孕的假孕母鼠输卵管中,对产出仔鼠的鼠尾组织DNA进行PCR、Southern blot检测,对9、20、24号转基因小鼠分别提取腹腔细胞、骨髓细胞及脾、肾组织总RNA和蛋白,并采用RT-PCR、Western blot方法进行转录水平检测和蛋白表达检测。结果共产生25只子代小鼠,经PCR和Southern检测获得7只阳性小鼠,经RT-PCR和Western blot检测结果表明,9、20、24号转基因小鼠腹腔细胞、骨髓细胞、脾、肾5-LO和5-脂氧化酶激活蛋白(FLAP)在RNA和蛋白水平表达均高于正常BDF1对照小鼠,且统计学分析腹腔细胞、骨髓细胞表达均具有显著差异(P0.05)。结论成功建立5-LO转基因小鼠模型。     

实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数

目的利用实时荧光定量PCR法鉴定转基因小鼠外源基因插入拷贝数。方法以TG-CARK转基因首见鼠为研究对象,选取小鼠的高度保守基因Fabpi为内参,利用绝对定量的实时荧光PCR法鉴定转基因小鼠拷贝数,并与传统的Southern blot方法的定量结果进行比较。结果实时定量PCR鉴定的转基因拷贝数与Southernblot法完全一致,三只TG-CARK首见小鼠的拷贝数分别为1,7,45。结论实时定量PCR技术具有高准确性、高稳定性、高通量和低成本的优点,是比传统杂交技术更好的鉴定小鼠转基因拷贝数的方法。