提高胚胎移植中受体牛妊娠率的研究进展

胚胎的质量和受体牛的质量是影响胚胎移植受体牛妊娠率的两具非人为因素。近年来人们在提高胚胎的质量和建立旨在提高受体牛质量的受体牛选择标准方面做了大量的工作,使胚胎移植工作中受体牛的妊娠率有了很大提高。本文从超数排卵、体外受精两种胚胎生产方法中如何提高胚胎的质量以及受体牛质量控制等方面了有关研究概况和发展动态。     

云南水牛的同期发情、超数排卵和胚胎移植试验

为探讨水牛胚胎移植的效果 ,于 2 0 0 2年对云南水牛进行了胚胎移植试验 :①用国产氯前列烯醇(PG) 0 6mg/头·次处理供、受体水牛的同期发情率和可用率分别为 4 3 33% (13/ 30 )和 16 6 7% (5 / 30 ) ;同期发情率经产水牛高于青年水牛 (P =0 0 86 ) ,杂交水牛高于德宏水牛 (P =0 15 3) ,体重 4 0 1～ 5 30kg水牛显著高于体重 30 0～ 4 0 0kg水牛 (P <0 0 5 ) ;发情明显水牛的可用率极显著高于发情不明显的水牛 (P <0 0 1)。②选用河流型摩拉水牛与沼泽型德宏水牛的杂交一代 5头为供体 ,分进口激素组 (n =2 )和国产激素组 (n =3)进行超数排卵 ,共有 2头获 9枚胚胎 ;进口激素组供体的平均获胚数和可移植胚数分别为 2 0枚和 1 5枚 ,比国产激素组分别多 0 33枚 (P =0 4 5 4 )和 1 17枚 (P =0 2 88)。③所获 4枚可用鲜胚分别移植 3头受体 ,结果 90d的妊娠率为 33 33% ,但最终无一头产犊。试验结果表明使用进口FSH 2 4mg +PG (Lutalyse○R) 35mg和国产FSH 11mg +PG 0 8mg对水牛超数排卵有效 ,同时提示需要足够数量的受体 ,从中选用发情表现明显、黄体发育良好的进行胚胎移植 ,才能取得良好效果。     

天祝白牦牛胚胎移植实验研究

选用健康成年天祝母白牦牛(Poephagus grunniens)(供体)10头、黑牦牛(受体)37头进行实验. 供体牛(组1)用CIDR-B+FSH＋PG进行同期发情和超数排卵; 受体牛(组2和组3)分别采用CIDR-B+PG和单次注射PG法进行同期发情. 结果表明, 平均黄体数、卵泡数、可移植胚胎数和退化胚胎数分别为4.75±2.19, 1.13±0.83, 2.50±1.31和1.38±0.92. 在3组中, 组1的同期发情率最高, 为80%, 组2和3分别为60%和45.5%. 处理后不同组别的发情开始时间不同, 组1的大部分白牦牛在处理结束后的25~75 h发情, 而组2和3的受体黑牦牛分别在73~96和49~72 h发情. 平均胚胎回收率55.6%. 共收集18枚可用胚胎, 将其中12枚移植到10头同期发情的受体牦牛, 最终妊娠率50%, 分娩率40%.     

激素诱发绵羊超数排卵及移植试验

胚胎移植,亦称受精卵移植,简单涵义就是:从一头优良母畜(简称供体)的输卵管内取出受精卵或早期胚胎,移植到另一头生产性能较差的同种或同品种母畜(简称受体)的相应部位,“借腹怀胎”,繁育后代。这项技术结合超数排卵,在畜牧业生产上应用后,可以充分发挥优良母畜的繁殖潜力,在短期内达到迅速扩大良种畜群的目的。随着受精卵保存技术的不断提高,如     

家畜胚胎移植技术

胚胎移植又叫受精卵移植和卵移术,也叫人工妊娠和借腹怀胎。 家畜胚胎移植的内容包括一整套技术程序,并不仅仅是采卵和植卵问题。首先要选择供体和受体。供体母畜必须是优良品种,遗传性能优良,身体健康、强壮;受体母畜要求价廉、健康,生殖器官无疾病,性周期正常。通过健康检查尤其是生殖器官检查,将供体和受体母畜确定下来。然后观察和记录供体、受体的性周期,为同步发情作准备,对供体还要进行激素处理,以导致其超数排卵达到提高繁殖力     

非人灵长类的体外受精和胚胎移植

非人灵长类的体外受精和胚胎移植是了解人类生殖机制,如卵的成熟调控,受精卵的成熟与分化,胚胎着床,控制某些遗传疾病以及保护珍稀灵长类和提高实验灵长类质量的有效途径。本文从非人灵长类卵的获取(包括超数排卵,非激素刺激动物取卵),精子处理(精液采集,冻存和精子获能),体外受精和胚胎移植、胚胎的冻存等方面介绍了有关研究概况和发展动态。     

受精卵注射CRISPR/Cas9系统制备基因编辑子午岭黑山羊技术体系的建立

受精卵注射CRISPR/Cas9系统是制备基因编辑动物的有效方法,其中受精卵收集效率、显微注射胚胎存活率及胚胎移植受体妊娠率是关键影响因素.以子午岭黑山羊为研究对象探讨了情期内不同时间点放置CIDR对超数排卵的影响;分析了胚胎供体和受体发情停止时间差异对胚胎移植妊娠率的影响;设计了3个打靶肌肉生长抑制素基因(MSTN)的小向导RNA(sgRNA),并优化了CRISPR/Cas9系统显微注射参数.结果表明,胚胎供体发情停止后第4天放置阴道栓可有效提高黄体数(15.25±3.69)和受精卵数量(13.875±4.015);利用微量注射泵将Cas9mRNA(60 ng/μL)和打靶MSTN基因的sgRNAs(60 ng/μL)混合液注射到受精卵胞质内,注射参数Pi,Ti和Pc分别为300,0.5和60,注射24 h后胚胎分裂率为76.79%.胚胎移植时受体发情结束时间晚于供体发情结束时间12~16 h妊娠率最高(38.46%).本研究共得到19个存活的个体,经TA克隆测序分析,所有个体MSTN打靶位点上均发现碱基的插入或缺失.综上,本研究以子午岭黑山羊为例,建立了受精卵注射CRISPR/Cas9系统制备基因编辑山羊的技术体系,为利用CRISPR/Cas9技术进行山羊的遗传改造奠定了技术基础.     

整合人mAAT基因转基因山羊的获得

旨在通过动物转基因技术开发奶山羊的乳腺生产治疗人肺纤维性囊肿的新药－人抗胰蛋白酶因子（人mAAT),选择繁殖机能优良的奶山羊56只作为供体,采用FSH＋LH做超数排卵,获取原核期胚,并进行显微注射和鲜胚移植,3月和5月两个月份超排处理后超排效果明显好于12月份,分别可获得平均排卵19．50,21．70和16．06枚,受精卵精分别为4．31,6．48和3．57枚,显微注射后胚胎移植给供体或自然发情的受体,移植受胎率分别为18．18％和25．00％,所生羔羊29只,对转入外外基因编码区N－末端和3‘调控区部分序列进行PCR,PCR-Southem和Southern检测,检出阳性转基因羊羔4只,基因的融合效率为13．79％。     

黑白花牛INHA基因多态性与超数排卵性状关系

为了研究黑白花牛抑制素α基因(INHA)的遗传多样性和超数排卵效果的关联分析,找到一种能够作为黑白花牛超数排卵预测的候选基因,本试验以50头黑白花牛为实验材料,对其进行了超排处理并且采集了黑白花牛的血液样本提取基因组。采用PCR-SSCP技术,在INHA基因的第一外显子和第二外显子各设计了一对引物进行基因型检测,然后与超排性状进行关联分析。结果表明:黑白花牛INHA基因的177 bp处(+1为转录起始位点)存在一个A>G突变的多态性位点,AA和AG基因型的频率分别为0.62和0.38。与超排性状关联分析,结果显示AG基因型黑白花牛的排卵数和鲜胚数均显著多于AA基因型(p<0.05),这说明黑白花牛个体的超排性状可能与其本身的INHA基因的遗传特性有关。     

家猫的胚胎工程

家猫是惟一一种没有被列为珍稀或濒危的猫科动物。通过家猫的胚胎工程研究,对保护其它濒危猫科物种有重要的借鉴意义。本文描述了家猫的一般生殖特点,着床前的胚胎在体内的发育概况;综述了近年来对家猫的超数排卵,卵母细胞的体外成熟,体外受精,胚胎的体外培养,胚胎移植,冷冻保存和胚胎克隆等方面的研究进展。     

溶菌酶1在小鼠超数排卵前后孵化及休眠囊胚中差异表达的研究

目的研究溶菌酶1(lysozyme 1,LYZ1)基因在超数排卵前后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中的分布以及表达,探究动物胚胎着床过程中新的调节机制。方法从妊娠5 d ICR小鼠体内获取的正常孵化囊胚和超排囊胚,利用小鼠延迟着床模型于妊娠第8天获取休眠胚胎和超排休眠胚胎。利用免疫荧光和Western Blot方法检测LYZ1蛋白在四组胚胎中的分布和差异表达变化。结果 LYZ1在超数排卵前、后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中均有表达,且主要集中在内细胞团中,滋养层细胞和胞质中少见分布;与未进行超排的小鼠相比,LYZ1蛋白在超排后小鼠胚胎中表达量显著上调,与未营造休眠模型的小鼠相比,LYZ1蛋白在休眠模型小鼠胚胎中的表达量显著上调。结论 LYZ1蛋白在囊胚内细胞团中表达,可能参与调节胚胎内细胞团的发育;LYZ1蛋白在超排-休眠胚胎中的高表达,说明LYZ1蛋白在休眠和超数排卵的双重影响下,会因为抵御不利环境而上调。     

SPF级小鼠超数排卵效果

目的探求小鼠周龄、品系和季节对SPF级小鼠超数排卵效果的影响。方法在春、夏、冬季对4～10周龄的SPF级BALB／c小鼠和KM小鼠进行超数排卵处理,通过见栓率、产胚率、3．5d胚胎获得量及胚胎类型等方面进行统计学分析。结果小鼠周龄、品系和季节对SPF级BALB／c小鼠和KM小鼠见栓率没有影响;对产胚率、3．5d胚胎获得量和胚胎类型等方面有一定影响。结论SPF级BALB／c小鼠宜用9、10周龄的进行超数排卵处理以供应3．5d胚胎为需要所用,而SPF级KM小鼠使用4～10周龄的都可以;另外,SPF级小鼠超数排卵处理仍宜在春、夏季进行,可以保证获得最佳的效果。     

猪胚胎玻璃化冷冻保存技术的优化

在以往工作的基础上本研究对现有猪胚胎玻璃化冷冻保存技术进行了优化。以巴马小型猪为供体,采用超数排卵技术,采集5~6日龄的胚胎(囊胚/桑椹胚),比较冷冻方法、胚胎承载工具胚胎、透明带处理和冷冻胚胎移植受体对猪胚胎冷冻效果的影响。结果表明,冷冻方法I[胚胎首先在冷冻液1(TCM199+20%FBS+10%EG+10%DMSO)中平衡3min,然后立即转入冷冻液2(TCM199+20%FBS+20%EG+20%DMSO+0.4mol/LSUC)中并在1min内装管(每管含2~6枚胚胎),直接投入液氮保存]与冷冻方法II[透明带完整的胚胎在NCSU23(含7.5μg/mLCB)培养液中平衡25min,13000×g离心12~13min,然后在含2mol/LEG的NCSU23中平衡5min,再在含8mol/LEG+7%PVP的NCSU23中快速漂洗,装进OPS/GMP管,放入液氮保存]冷冻效果没有显著差异;GMP法能显著提高冷冻胚胎存活率(83.8%vs77.6%,P<0.05)和囊胚细胞数(47.5vs53.1,P<0.05);以0.5%链蛋白酶(Pronase)处理透明带10s,虽然对猪胚胎存活率没有显著影响,但能...     

牛体细胞核移植显微操作环节的优化

本研究从牛卵母细胞去核方法(纺锤体观测仪法&Hoechst33342染色法)、供体细胞核引入去核卵细胞质的方法(卵细胞质注射法和电融合法)和重构胚胎电融合(3组参数)等3个环节对牛体细胞核移植的显微操作过程及相关参数进行了筛选优化。以核移植胚胎的卵裂率、囊胚发育率作为检测指标,对不同的方法所获得的克隆胚胎的卵分裂率与囊胚发育率进行比较,最后筛选获得1个优化的牛体细胞核移植操作程序,即采用Spindle view系统对牛卵母细胞进行去核操作,将供核体细胞注射到卵周隙,然后通过电融合法将供体核引入去核卵细胞质(电融合参数为1.9kV/cm,脉冲时程10μs,方波2次间隔2s)。以此核移植程序进行牛体细胞核移植实验,自获得克隆胚胎中筛选80枚优质囊胚移植到33头受体牛子宫内,最后2头母牛产下2头克隆牛犊,结果表明利用该优化的显微操作环节进行牛体细胞核移植可以获得体细胞克隆牛犊。     

利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛 （英文）

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。     

周龄和激素水平对长爪沙鼠超数排卵效果的影响

目的探讨不同周龄和激素水平对长爪沙鼠超数排卵效果的影响,以期确定长爪沙鼠最佳超排周龄和激素使用剂量。方法腹腔注射10 IU PMSG/HCG对4～18周龄8个年龄段的雌性长爪沙鼠进行超数排卵,末次注射16～17 h内对各组动物卵母细胞计数,确定最佳超排周龄后,对该年龄动物以5、10、15 IU3个剂量水平腹腔注射PMSG/HCG,观察各组动物的卵母细胞计数差异。结果与其它周龄组相比,6周龄组长爪沙鼠超数排卵后的卵母细胞数最多,各组间有统计学意义（P〈0.05）,而5、10、15IU等3个剂量组的超排效果也有一定的差异,10 IU组数量最高。结论对长爪沙鼠而言,采用10 IU激素注射和6周龄的动物进行超数排卵,获得的卵母细胞数量最多而且超排效果稳定性。     

日本地方自治体纷纷使用流动式胚胎移植车使牛胚胎移植事业化

牛的胚胎移植(ET,embryo transfer)是缩短牛的改良期限、大量增殖优良牛的有效手段。ET有许多优点:能缩短开发优良种公牛的时间、分别产出雄雌牛、能产双胎、能在採乳用黑白花牛借腹生产出黑毛日本犊牛,能从一年通常只能获得一个胚胎的雌牛,获得多达20个胚胎。ET技术也是日本畜产业适应牛肉生产自由化形势,以敞开供应高品质、低成本牛肉的,“迎接未来”的技术,所以各自治体都很重视。国家的补助也向ET实用化倾斜为了普及ET,农林水产省从1982年开始向都、道、府、县进行补助。自治体的ET     

利用超数排卵方法高效获取小鼠休眠胚胎

目的为提高小鼠休眠胚胎的制备效率,尝试用超数排卵方法获取小鼠休眠胚胎。方法超排小鼠在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后,按照是否注射抗孕马血清(anti-PMSG serum或A-PMSG)以及注射的不同时间分为5组:在母鼠合笼前注射A-PMSG、在母鼠见栓后注射A-PMSG、在见栓第四天卵巢摘除手术后注射A-PMSG、不注射A-PMSG的超排组和不超排组。结果见栓后注射抗PMSG组的平均出胚数(9.4枚/只)最高,显著高于其他实验组。结论常规超排处理结合注射抗PMSG血清法能有效提高小鼠休眠胚胎的回收率。     

不同品种肉羊胚胎移植效率的研究

以无角多赛特、萨福克、德克赛尔、东福利生纯种肉用绵羊为供体,以内蒙古小尾寒羊为受体,利用辅助生殖技术对纯种群体进行扩繁,并对不同品种肉羊的超排及胚胎移植效果进行了比较.结果显示,无角多赛特和萨福克的平均超排胚胎数明显高于德克赛尔和东福利生(P<0.05);将2523枚A级囊胚进行移植,总产羔率为51.32%,以无角多赛特产羔率明显优于其他品种肉羊(P<0.05);手术和腹腔镜移植技术对引进的纯种绵羊产羔率没有影响,但腹腔镜移植技术对受体造成的创口小,操作快捷.     

用来提高动物繁殖力的胚胎移植技术

胚胎移植是从供体雌畜收集胚胎并移给受体雌畜使之成为继续妊娠的代理母亲的技术。胚胎移植技术几乎已经用于每种家畜和多种野生动物,包括人类和灵长类。近十年来,胚胎移植程序日趋精密。包括在牛中完善使用非手术移植方法,长期胚胎培养和冷冻保存以及最近的显微操作和许多与遗传工程有关的技术。这是一门迅速发展并且大火缩短了发明和使用之间的时间隔的科学。随着新技术的发展,潜在用途继续增加。Walter Heape 1890年报告他得到一窝用胚胎移植方法出生的小兔。