血清孕酮水平检测在克隆胚胎移植受体牛的筛选及妊娠诊断中的应用

目的:孕酮(progesterone,P4)作为一种生殖激素,在牛的发情期和妊娠期呈规律性变化,且在妊娠的建立和维持过程中发挥着重要作用。拟应用孕酮浓度测定辅助人工观察筛选克隆胚胎移植受体牛并监测其整个妊娠过程。方法:通过对自然配种牛不同生殖阶段血液中孕酮水平的分析,建立其在发情初期、妊娠期孕酮浓度的变化规律,以此为依据辅助人工观察筛选适合胚胎移植的受体牛。同时将在体外培养7天后的体细胞核移植重构囊胚移植到所筛选出的同期发情的受体牛子宫内,并应用孕酮测定监测其妊娠状态。实验结果:(1)运用孕酮检测筛选克隆胚胎移植受体牛时,当孕酮浓度在发情第0天和第5天分别为≤0.64nmol/L和2～8nmol/L时,适宜作为胚胎移植受体牛,根据此筛选指标能够排除50%左右假发情牛。(2)运用孕酮检测较传统的人工观察方法,胚胎移植的克隆牛出生率提高了7.1倍。结论:运用牛血清孕酮检测方法能有效提高母牛生理周期判断的准确性,有利于选择合适的胚胎移植受体牛,既能实时、有效地监测怀孕受体牛的妊娠状态,又避免了靠人工观察受体牛返情、流产时的人为疏漏和误判,有效地提高受体牛的利用率,提高克隆牛的生产效率,并能推广应用于畜牧行业牛的生产繁育中。     

影响杜泊羊冷冻胚胎移植成功率的因素

采用引进的杜泊羊冷冻胚胎,以云南当地绵羊为受体进行胚胎移植。同期发情处理了158只受体羊,同期发情率为82．91％;对102只进行了胚胎移植,实际移植率为77．86％,3个情期内移植妊娠率达74．5％;出生68只,产羔率达66．7％。分析表明,胚胎发育阶段及级别、卵巢黄体情况、以及胚胎移植技术熟练程度直接影响胚胎移植成功率;此外,受体羊的处理程序及移植后的饲养管理、移植时机的把握、移植季节以及胚胎冷冻及解冻方法也会影响杜泊羊移植妊娠率,进而影响产羔率。     

受体品种、体重及移植季节对杜泊羊胚胎妊娠率和新生羔羊体重的影响

胚胎移植可以提高家畜良种扩大的速度,但移植成功率会受到很多因素的影响。用6.5～7.5日龄杜泊羊冷冻胚胎作为移植胚胎,研究了季节和受体状况对杜泊羊胚胎移植妊娠率以及出生羔羊生长发育的影响。在比较春秋两季236枚冷冻胚胎的移植效果发现秋季移植的妊娠率(68.6%)显著高于春季(58.5%);春季和秋季移植后出生羔羊的体重,初生时无显著差异;但在30日和60日(断乳)时,春季移植的羔羊显著高于秋季。比较不同品种的受体发现,昭通绵羊受体的胚胎移植妊娠率最高,湖羊次之,小尾寒羊最低,但受体羊3种品种间无显著差异;较大受体羊(≥40kg)生产的羔羊出生和30d的体重显著高于较小受体(<40kg);但60d羔羊体重差异不显著,说明受体体重会影响羔羊的出生体重,但是对哺乳期的生长发育影响不大。春季移植出生的羔羊,其早期生长发育情况明显优于秋季。     

法国宣布首次用DNA探针鉴别牛胚胎的性别

据《Newswatch》报道,由30名法国科学家组成的一个特别工作小组宣布制造了一种测定一周龄牛胚胎性别的方法,这种方法是以雄性具有的 Y 染色体的 DNA 杂交为基础。据说,到目前为止还没有人发现牛胚胎在发育的第6天就能鉴别出性别的方法。用 DNA 探针鉴别牛胚胎性别的优点是:1.运输已知性别的冷冻胚胎通过国境时要经过管理运输方面的多项国际卫生法规的检查;2.将使牲畜的生产和销售更简单、便宜;3.畜群管理人员可以预先知道公牛数和母牛数;4.能够将两个雄性胚胎移植给一个受体母牛,     

受精卵注射CRISPR/Cas9系统制备基因编辑子午岭黑山羊技术体系的建立

受精卵注射CRISPR/Cas9系统是制备基因编辑动物的有效方法,其中受精卵收集效率、显微注射胚胎存活率及胚胎移植受体妊娠率是关键影响因素.以子午岭黑山羊为研究对象探讨了情期内不同时间点放置CIDR对超数排卵的影响;分析了胚胎供体和受体发情停止时间差异对胚胎移植妊娠率的影响;设计了3个打靶肌肉生长抑制素基因(MSTN)的小向导RNA(sgRNA),并优化了CRISPR/Cas9系统显微注射参数.结果表明,胚胎供体发情停止后第4天放置阴道栓可有效提高黄体数(15.25±3.69)和受精卵数量(13.875±4.015);利用微量注射泵将Cas9mRNA(60 ng/μL)和打靶MSTN基因的sgRNAs(60 ng/μL)混合液注射到受精卵胞质内,注射参数Pi,Ti和Pc分别为300,0.5和60,注射24 h后胚胎分裂率为76.79%.胚胎移植时受体发情结束时间晚于供体发情结束时间12~16 h妊娠率最高(38.46%).本研究共得到19个存活的个体,经TA克隆测序分析,所有个体MSTN打靶位点上均发现碱基的插入或缺失.综上,本研究以子午岭黑山羊为例,建立了受精卵注射CRISPR/Cas9系统制备基因编辑山羊的技术体系,为利用CRISPR/Cas9技术进行山羊的遗传改造奠定了技术基础.     

两温度梯度多重PCR鉴别牛早期胚胎性别的技术研究

稳定、可靠和快速的牛胚胎性别鉴定方法在生产应用中具有重要意义。通过两温度梯度PCR方法对牛基因组、克隆胚胎、胚胎样品进行性别鉴别实验研究,建立了稳定、简便、快速的牛早期胚胎性别鉴别两温度梯度PCR方法,鉴定时间仅为57分钟。采用两温度梯度PCR方法对30枚奶牛胚胎进行了早期性别鉴别,并将鉴别的15枚胚胎（11枚为雌性,4枚为雄性）移植到同期处理的15头受体母牛体内。60天后妊娠检查,有7个受体成功受孕,5头受体怀孕晚期流产,流产犊牛全部为母犊。结果产下1公1母两头犊牛,流产个体与出生个体的性别与PCR鉴别结果完全相符。      

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用．本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪．将sFat—1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植．先后移植了1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠（90％）,7头妊娠足月（70％）分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1．1％（出生仔猪／移植胚胎）．体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响．当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率（100％）,而排卵后移植妊娠足月率为0％．对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87％．RT—PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat—1基因．以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFat-1基因的克隆猪．     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用.本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪.将sFat-1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植.先后移植了1889枚1~4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠(90%),7头妊娠足月(70%)分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1.1%(出生仔猪/移植胚胎).体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响.当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率(100%),而排卵后移植妊娠足月率为0%.对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87%.RT-PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat-1基因.以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFa...     

两温度梯度多重PCR鉴别牛早期胚胎性别的技术

稳定、可靠和快速的牛胚胎性别鉴定方法在生产应用中具有重要意义.通过两温度梯度PCR方法对牛基因组、克隆胚胎、胚胎样品进行性别鉴别实验研究,建立了稳定、简便、快速的牛早期胚胎性别鉴别两温度梯度PCR方法,鉴定时间仅为57分钟.采用两温度梯度PCR方法对30枚奶牛胚胎进行了早期性别鉴别,并将鉴别的15枚胚胎(11枚为雌性,4枚为雄性)移植到同期处理的15头受体母牛体内.60天后妊娠检查,有7个受体成功受孕,5头受体怀孕晚期流产,流产犊牛全部为母犊.结果产下1公1母两头犊牛,流产个体与出生个体的性别与PCR鉴别结果完全相符.     

慢病毒介导的牛生长素基因对小鼠胚胎发育的研究

生长素是促进动物生长发育所必需的激素之一。本研究探索牛生长激素(bovine growth hormone,bGH)对小鼠胚胎发育的影响。将牛生长激素基因连接到慢病毒载体(Lenti-CMV-EF1-eGFP)形成Lenti-CMV-bGH/EF1-eGFP,重组病毒经293T细胞包装后直接感染小鼠胚胎和G1胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)。阳性表达的胚胎经体外培养,发育到囊胚期的胚胎进行胚胎移植,为直接感染组。感染的小鼠G1胚胎干细胞注射到正常昆明白小鼠囊胚制作嵌合胚胎后进行胚胎移植,为嵌合体组。分别解剖3只妊娠15d的直接感染组和嵌合组的小鼠,观察受体小鼠妊娠情况。结果发现,在1-细胞期感染胚胎,感染效率可达(74.7±6.7)%,在2-细胞期连续感染,感染效率为(79.4±5.7)%,两组感染方法的效率没有显著差异(P>0.05)。1次和2次感染胚胎发育和正常胚胎之间没有显著差异((87.6±3.5)%,(85.4±6.3)%VS(83.0±5.5)%,P>0.05)。所有移植的胚胎没有发育到足月,解剖妊娠15d的小鼠,发现直接感染组没有妊娠,嵌合组胎盘发育正常,但胚胎部分已经死亡和被吸收。因此,本研究证明bGH对小鼠附着前胚胎发育没有影响,但影响小鼠胚胎附着后的发育。这为后期bGH的研究提供参考。     

中国的动物胚胎技术研究进展

胚胎移植技术最早是由英国的Walter Heape率先研究的,随后经过了胚胎学家几十年的努力才在上个世纪来期逐渐开始广泛应用于医学生殖,畜牧业,动物保种等领域。本文集中论述中国的胚胎移植技术发展以及它在畜牧业领域的应用。 在中国商业性的动物胚胎移植正在蓬勃发展,其成功率已经和国外同行相差不大。通过胚胎移植工作者的努力,一些从事商业性胚胎移植的公司已经能够做到鲜胚移植后奶牛的妊娠率55％～70％,冷冻胚胎的妊娠率达到45％～60％。不仅如此,在各个省还建立了自己的专门的冷冻胚胎中心,为本省的畜牧产业提供胚胎或者相关的服务。 在动物保种方面,胚胎技术给人们提供了一种全新的思路：通过胚胎技术将活的胚胎冷冻在液氮罐以实现永久保存。例如中国科学院动物所陈大元先生提出通过胚胎移植技术实现对大熊猫的物种保存,并取得了一定的成果。 随着经济和社会的进一步发展,人民生活水平的提高对于肉和奶的需求会进一步提高。依靠常规的选育技术来改良牲畜是无法满足人民对于畜牧产品急切要求,要实现畜牧业的跨越式发展,就必须依靠科技的力量来实现畜牧业的大发展,满足人民生活需要。胚胎技术等新技术会为我国的畜牧业的产业提高提供了一个新的机遇,可以相信,在不远的将来,动物胚胎技术必将在中国有一个较大发展。     

移植胚胎数目对高龄不孕患者IVF-ET结局的影响

目的:探讨移植胚胎数目对高龄不孕患者IVF-ET结局的影响.方法:根据移植胚胎个数将年龄超过35岁的不孕患者338个周期分为单胚胎移植组(Ⅰ组),2个胚胎移植组(Ⅱ组),3个胚胎移植组(Ⅲ组).分析患者IVF治疗情况并按年龄分层比较三组患者的IVF-ET结局.结果:高龄不孕患者行IVF,随年龄增加,获卵数、优质胚胎率和临床妊娠率降低,流产率呈增高趋势.Ⅰ组的妊娠率9.43%,显著低于Ⅱ组(24.24%)和Ⅲ组(31.37%)(P＜0.05).对于40岁以下的患者,移植3个胚胎的妊娠率与移植2个胚胎差无异,但显著高于移植1个胚胎(P＜0.05).增加40岁以上患者移植胚胎的数目,妊娠率未出现有统计学意义的升高.三组的胚胎种植率分别为9.43%,12.12%和12.2%,无统计学差异.Ⅲ组中多胎率12.5%(6/48),其中35～36岁年龄段多胎率16.67%(5/30).结论:高龄不孕患者可移植的胚胎数目随年龄增加和获卵数目降低而降低.其中较年轻者(35～36岁年龄段),移植3个胚胎,对妊娠率提高无明显效果,但多胎发生显著增加.     

牛超数排卵技术研究进展

超数排卵是获得牛胚胎移植研究与应用所需可移植胚胎的重要途径。由于影响供体牛超数排卵的因素众多、复杂,几十年来供体牛每次超数排卵所获得的平均可移植胚胎数几乎没有增加,因此,如何提高超排效果成为研究热点。综述了近年来牛超排的最新研究进展,以期为牛超排效果的改善和胚胎移植效率的提高提供参考。     

移植胚胎数目对高龄不孕患者IVF—ET结局的影响

目的：探讨移植胚胎数目对高龄不孕患者IVF—ET结局的影响。方法：根据移植胚胎个数将年龄超过35岁的不孕患者338个周期分为单胚胎移植组（I组）,2个胚胎移植组（Ⅱ组）,3个胚胎移植组（Ⅲ组）。分析患者IVF治疗情况并按年龄分层比较三组患者的IVF-ET结局。结果：高龄不孕患者行IVF,随年龄增加,获卵数、优质胚胎率和临床妊娠率降低,流产率呈增高趋势。Ⅰ组的妊娠率9．43％,显著低于Ⅱ组（24．24％）和Ⅲ组（31．37％）（P〈0．05）。对于40岁以下的患者,移植3个胚胎的妊娠率与移植2个胚胎差无异,但显著高于移植1个胚胎（P〈0．05）。增加40岁以上患者移植胚胎的数目,妊娠率未出现有统计学意义的升高。三组的胚胎种植率分别为9．43％,12．12％和12．2％,无统计学差异。Ⅲ组中多胎率12．5％（6／48）,其中35-36岁年龄段多胎率16．67％（5／30）。结论：高龄不孕患者可移植的胚胎数目随年龄增加和获卵数目降低而降低。其中较年轻者（35-36岁年龄段）,移植3个胚胎,对妊娠率提高无明显效果,但多胎发生显著增加。     

优良的BMPR-IB基因型可提高绵羊冷冻胚胎的受胎效果

以控制BooroolaMerino羊高繁殖力的BMPR-IB基因为候选基因,以小尾寒羊及其杂交羊、东北半细毛羊、澳洲美利奴羊、德国肉用美利奴羊、萨福克羊、特克塞尔羊、夏洛莱羊为试验对象,采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行基因单核苷酸多态性(SNP)检测和基因型分析,同时研究基因对高繁殖力的影响.研究结果表明:小尾寒羊及其杂交羊、东北半细毛羊和夏洛莱羊群体中发现了与BooroolaMerino羊相同的A746G碱基突变,而小尾寒羊及其杂交羊群体的B等位基因频率明显高于其他2个品种.另外4个品种中未发现此突变.携带B等位基因的群体较非携带B等位基因群体排出更多的卵子,排卵后黄体直径较小.移植入冷冻胚胎后, 、B 和BB3种基因型群体的妊娠率分别为38.78%、45.71%和66.67%.由此推断,BMPR-IB基因突变很有可能从增加卵巢排卵数和提高胚胎着床及妊娠建立效率两个方面同时影响绵羊高繁殖力性状.所得BB型群体冻胚移植妊娠率明显高于 和B 型群体,已接近鲜胚移植水平,通过PCR-RFLP方法进行基因型分析,选用合适基因型群体作为胚胎移植受体,有可能为提高绵羊胚胎移植受胎率提供新的方向.     

试管牛和试管羊胚胎性别的鉴定

奶牛和山羊的卵母细胞经过体外成熟、体外受精和体外发育至桑椹期,在显微操作下,吸取4～6个胚胎细胞,应用巢式PCR技术对其DNA进行SRY基因的测定以进行胚胎性别鉴定。共有27枚转有外源基因的试管牛胚胎和207枚转基因试管羊胚胎进行了SRY基因检测。选取10枚经过性别鉴定的牛胚胎移植于8头受体母牛和124枚已知性别的羊胚胎移植于44头受体母羊,移植后妊娠率分别为37．5％（牛,3/8）和61．4％（羊,27/44）。最后产生1头分娩牛犊和2头流产胎牛以及14头分娩羊羔和2头流产胎羊,它们的性别与胚胎性别鉴定的结果完全相符。 Abstract: The oocytes of bovines and goats were subjected to in vitro maturation,in vitro fertilization(IVF)and in vitro development upto morula stage．4～6 embryonic cells were aspirated with micro-manipulating and the embryo sexes were identified by detecting SRY gene with nested PCR procedure．A total of 27 transgenic IVF bovine and 207 transgenic IVF goat embryos were performed SRY gene detection．10 bovine and 124 goat sexed embryos were selected to be transferred into 8 bovine and 44 goat recipients,respectively,leading to the pregnant rates of 37．5％( in bovine,3/8)and 61．4％(in goat,27/44)．In the end,1 cattle and 14 goatlets were born at term but 2 fetal bovine and 2 fetal goats were miscarried．Their sexes were fully in accordance with the embryonic sex predetermination．     

牛胚胎工程实用化研究通过验收

浙江省农科院畜牧研究所通过 4年的攻关 ,已完成省“九五”重点项目“牛胚胎工程技术实用化研究” ,于2 0 0 0年 10月通过专家验收。该项研究已基本形成了同步发情—胚胎选择—胚胎移植—受体饲养管理的实用技术体系 ,为我省应用高新技术 ,建立良种牛繁育体系提供了技术保证。浙江省因良种覆盖率低 ,牛群品质较差 ,每头奶牛年均产奶量及肉牛平均胴体重都远远低于国外水平 ,急需引进优质种源 ,改良牛群 ,提高生产效益。但引进活畜价格昂贵 ,运输困难 ,检疫繁琐 ,而引进优质奶牛、肉牛的冷冻胚胎 ,既可以利用浙江省本地母牛作受体 ,节省成本 ,…     

表皮生长因子受体在体外受精-胚胎移植胎盘及胚胎组织中表达及意义

目的研究辅助生殖中体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization-Embryo Transfer, IVF-ET)技术本身对早期胎盘绒毛和胚胎组织中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)及其基因表达影响。方法收集辅助生殖IVFET来源,双胚胎移植妊娠45~60d,经超声引导下减胎获得胎盘绒毛和胚胎组织各8例,作为研究组,对照组采用自然妊娠双胎45~60d人工流产中获得的胎盘绒毛和胚胎组织各10例。免疫组织化学和实时荧光定量RT-PCR检测组织中EGFR蛋白和m RNA的表达及分布差异。结果 EGFR表达于胎盘绒毛细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞的细胞膜和细胞质,广泛表达于胚胎各个胚层;IVF-ET来源胎盘绒毛组织中EGFR免疫反应性显著低于自然妊娠组,在IVF-ET和自然妊娠胚胎组织中表达无明显差异; EGFR mRNA在IVF-ET胎盘绒毛组织中低表达,而在胚胎组织中表达无显著性差异。结论 EGFR蛋白和基因在IVF-ET胎盘绒毛组织中表达低于自然妊娠组织,而在胚胎组织中表达无明显差异,显示IVF-ET技术本身更加倾向于影响胎盘发育和功能,EGFR可能在IVF-ET相关疾病发病机制中发挥作用。     

下一代测序技术在高龄女性的胚胎植入前非整倍体遗传学检测中的应用

本研究以微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization, aCGH)平台为参照,旨在探究基于下一代测序(next-generation sequencing, NGS)的胚胎植入前遗传学非整倍体检测(preimplantation genetic testing for aneuploidies, PGT-A)对高龄不育患者辅助生殖临床结局的影响.本文回顾性分析了上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院2016年6月至2019年3月行PGT-A的104对夫妇的临床资料,共纳入125个移植周期,其中正常胚胎移植周期为107个,嵌合体胚胎移植周期为18个.主要结果指标包括正常囊胚检出率和嵌合体囊胚检出率,以及临床妊娠率、流产率和活产率.研究结果表明,与a CGH平台相比, NGS的嵌合胚胎的检出率显著提高,且部分嵌合体胚胎移植获得了健康胎儿.对于移植检测结果为正常的胚胎,基于NGS的PGT-A和基于aCGH的PGT-A对高龄女性辅助生殖的临床妊娠率、流产率和活产率的影响无显著差异.     

用来提高动物繁殖力的胚胎移植技术

胚胎移植是从供体雌畜收集胚胎并移给受体雌畜使之成为继续妊娠的代理母亲的技术。胚胎移植技术几乎已经用于每种家畜和多种野生动物,包括人类和灵长类。近十年来,胚胎移植程序日趋精密。包括在牛中完善使用非手术移植方法,长期胚胎培养和冷冻保存以及最近的显微操作和许多与遗传工程有关的技术。这是一门迅速发展并且大火缩短了发明和使用之间的时间隔的科学。随着新技术的发展,潜在用途继续增加。Walter Heape 1890年报告他得到一窝用胚胎移植方法出生的小兔。