胚胎干细胞分化潜能研究进展

胚胎干细胞(ESC)是来源于哺乳动物早期胚胎的一种具有多向分化潜能的细胞。目前已经从胚胎干细胞分化培育出了心肌细胞,神经细胞,血管内皮细胞和壁细胞,胰岛细胞等。胚胎干细胞的诱导分化可以从形成拟胚体途径,也可以直接分化。对胚胎干细胞的研究具有广阔的应用前景,但也存在很多问题尚待解决。     

血管紧张素Ⅱ在胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

为检测血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AⅡ）对小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）向心肌细胞方向分化的作用,采用10-4 mol/L维生素C诱导小鼠R1胚胎干细胞分化为心肌细胞. Western印记检测胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中表达血管紧张素Ⅱ1 型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R).诱导分化期间用1 μmol/L AⅡ刺激胚胎干细胞,计数搏动拟胚体的比例;诱导分化第14 d用real-time RT-PCR 和Western 印记检测心肌标志物的表达确定其作用. 结果显示,与对照组相比,1 μmol/L AⅡ处理组可显著增加搏动拟胚体的比例,上调心肌标志物mRNA的表达. 预先用1 μmol/L洛沙坦处理1 h后可显著阻碍这种上调作用. 本实验结果表明,AⅡ通过AT1R可促进小鼠R1胚胎干细胞向心肌细胞分化.     

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1 (Pofut1)基因缺失可导致Notch分子无法与配体结合并启动信号传递. 为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞（ESC）向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体（EB）分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达. 结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;Notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.     

人胚胎干细胞传代培养及细胞化学染色特性

目的 体外建立人胚胎干细胞传代培养方法,研究人胚胎干细胞细胞化学染色特性.方法 以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层传代培养人胚胎干细胞,检测人胚胎干细胞、自发分化克隆及拟胚体的细胞化学染色特性.结果 人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传30代以上其形态保持不变;人胚胎十细胞碱性磷酸酶、过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性,自发分化克隆细胞阳性程度明显减弱;人胚胎干细胞形成的拟胚体碱性磷酸酶染色弱阳性,过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性.结论 小鼠胚胎成纤维细胞能支持人胚胎干细胞传代培养,细胞化学染色结果能初步鉴别人胚胎干细胞未分化特性.     

齐墩果酸诱导多种小鼠胚胎干细胞向生殖细胞方向分化研究

目的：寻找一种能诱导多种胚胎干细胞向生殖细胞方向分化的化合物,并以常用的诱导物维甲酸（Retinoic Acid, RA）作为阳性参照物。方法：分别培养小鼠胚胎干细胞1 B10、D3、R1／E,诱导它们形成拟胚体,让拟胚体贴壁生长,加入特定化合物诱导贴壁细胞分化,诱导72 h后,提取被诱导细胞的RNA,再合成cDNA,最后利用实时荧光定量PCR检测各被诱导细胞中与生殖分化相关的基因的表达水平的变化。结果：发现齐墩果酸（Oleanolic Acid,OA）显著上调了所有被研究的小鼠胚胎干细胞的生殖分化关键基因的表达水平,同时发现阳性参照物RA仅能诱导1 B10、R1／E ,而不能诱导D3向生殖细胞方向分化。结论：OA能诱导多种胚胎干细胞向生殖细胞方向分化,诱导能力方面具有比常用诱导物维甲酸更广泛的普遍性。     

利用胚胎干细胞分化的拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程

小鼠胚胎干细胞(ES细胞)具有分化的全能性已经得到广泛共识。ES细胞在体外分化所形成的拟胚体在结构上能够模仿早期胚胎发育过程,包括在内细胞团表面形成内胚层、柱状上皮细胞的分化,以及中央空腔的形成。本文介绍利用拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程中各个胚胎阶段的发育、细胞程序性死亡的发生及TGF-β信号在胚胎发育过程中的作用。     

通过形成类胚体诱导人羊水多能干细胞向心肌细胞分化

由人羊水中分离羊水多能性干细胞,通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化.取人羊水标本进行体外培养,分离得到人羊水干细胞,已连续传代培养至42代,采用免疫细胞化学、RT-PCR和流式细胞仪技术对羊水干细胞的生物学特性进行检测.取10～15代羊水干细胞,悬浮培养使其形成类胚体,进而向心肌细胞诱导分化.培养的羊水干细胞呈成纤维样,表达部分胚胎干细胞特异标志基因,悬浮培养可形成类胚体.类胚体碱性磷酸酶(AP)检测呈阳性,表达三胚层特异标志基因fgf5、ζ-globin和α-fetoprotein.羊水干细胞形成类胚体后进行诱导,得到α-actin阳性细胞,表达心肌细胞特异标志基因Tbx5、Nkx2.5、GATA4和α-MHC.试验结果表明,从人羊水标本中可分离得到具有胚胎干细胞特性的细胞,经初步检测确定为羊水干细胞,并能通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化.     

人胚胎干细胞和拟胚体基因表达谱的初步分析

利用人类全基因组Affymetrix芯片检测人胚胎干细胞与其自发分化7d的拟胚体之间的差异表达基因.结果显示:与未分化的人胚胎干细胞相比.在分化7d的拟胚体中表达下调2倍及以上的已知和未知基因共有1100个,表达上调2倍及以上的已知或未知基因共有2283个.利用Gostat对这些差异表达基因进行功能分析,发现它们分别与细胞的生物代谢过程、信号传导通路、系统发育、细胞分化、分子功能及亚细胞组分相关.胚胎干细胞具有自我更新能力,是研究早期胚胎发育理想的细胞模型,因此对差异表达基因的功能研究有助于了解维持人胚胎干细胞自我更新的分子机制以及胚胎发育早期的分子事件.     

人类胚胎干细胞体外诱导分化为神经干细胞

人类胚胎干细胞是替代治疗充满希望的细胞来源. 描述了从人胚胎干细胞诱导分化出神经干细胞的方法. 将人胚胎干细胞系PKU1, PKU2在细菌培养皿中悬浮培养, 分化形成囊性拟胚体. 拟胚体接种至组织培养皿, 加入N2培养液和生长因子bFGF培养2周, 拟胚体贴壁、展开,中心出现灶状增生, 有突起的小细胞. 用机械方法取下此种细胞, 重新接种, 则细胞团悬浮生长,形成神经球. 培养10天后, 将神经球打散成单细胞接种, 该细胞贴壁生长旺盛. 免疫荧光检测显示为几乎100% 纯净的nestin阳性细胞. 将培养液中的生长因子撤除, 继续培养7~10天, 细胞分化为神经元, 该细胞呈现β-tubulin isotype_Ⅲ 阳性、GABA阳性、serotonin阳性、synaptophysin阳性. 在生长因子PDGF-AA诱导下, 细胞分化为星形胶质细胞, 其GFAP阳性; 或少突胶质细胞, 其O4阳性. 可见, 人类胚胎干细胞经上述方法培养可分化为典型神经干细胞, 表达神经干细胞特异的标志分子nestin、能自我更新、具有分化为神经系统三类主要细胞的能力.     

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

目的探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体（embryonic body,EB）法和直接分化法的不同效率。方法人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组：A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT-PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果RT-PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义（P〈0.01）,且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。     

Rat bone marrow derived mesenchymal progenitor cells support mouse ES cell growth and germ-like cell differentiation

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) have been used as feeder cells to support the growth of mouse embryonic stem cell (mESC) and primordial germ cells (PGC) in culture for many years. However, MEF preparation is a complex and tedious task. Recently, there are reports indicating that the microenvironment provided by bone marrow stromal cells could support the survival of embryonic-like stem cells in bone marrow. In this report, rat bone marrow derived mesenchymal progenitor cells (MPC) were used as feeder cells to culture mouse Oct4-GFP ES cell and ES cell derived germ cells. FACS results show that similar to MEF, rat MPC could efficiently support growth of the mouse Oct4-GFP ES cell line in culture (MPC 85.5 ± 5.1% vs MEF 84.1 ± 6.2%). ES cells could be subcultured for >15 passages without losing morphological characteristics. The cultured cells expressed stem cell marker alkaline phosphatase, Oct4, Sox2, and SSEA-1. Furthermore, rat MPC cells were able to support survival of germ cells isolated from mouse Oct4-GFP ES cell formed embryoid bodies (EB). After induction by retinoic acid for 7 days, some isolated cells differentiated to spermatogonial stem-like cells, expressing Mvh, Stra-8, Hsp90-α, integrinβ1 and α6. Compared with traditional MEF culture systems, the rat MPC culture system is effective in supporting ES cell growth and is easy to prepare.     

6-DMAP和胚胎干细胞代数对异种重构卵体外发育的影响(简报)

核移植技术已经广泛应用于动物克隆,但是克隆动物的成活率仍然很低。许多克隆胚胎死于妊娠期,少部分能发育到期,正常出生,但多数在出生后由于心肺和消化道的问题,很快就夭折,有些克隆动物有异常表型,如出生时体重和胎盘过大等。研究发现,在同种克隆动物实验中用胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)作为核供体,发育到期的克隆动物比例明显高于体细胞,并且用杂交一代的小鼠ES细胞为核供体,绝大多数克隆仔     

Effects of feeder layer and BRL conditioned medium on mouse embryonic stem cells

In vitro growth and maintenance of embryonic stem (ES) cell lines derived from ICM cells of various blastocysts of 129 strain mice,the sustenance of their pluripotency and normal karyotype depend on the feeder layer of mouse embryonic fibroblasts (MEF).Compared with the feeder layer of MEF cells,medium conditioned by Buffalo rat liver cells (BRL-CM) is able to maintain pluripotency and karyotypic normality of ES cells only in short term cell propagation.Besides,ES cells grown in BRL-CM are also capable of aggregation with 8-cell embryos of Swiss strain and develop into germ line chimaeras.Modification to the method of aggregating ES cells with early embryos by making a hole in agar layer on the top of MEF feeder cells was shown to be more converient and efficient than the conventional microdrop method.     

小鼠胚胎干细胞在六种培养体系的培养观察

目的　观察小鼠胚胎干细胞在六种培养体系中的生长情况。方法　小鼠胚胎干细胞 (ESD3细胞株 )在以下六种培养体系中培养 :1 .原代小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)有血清培养 ,2 .MEF无血清培养 ,3.SNL细胞有血清培养 ,4.LIF(白血病抑制因子 )有血清无饲养层培养 ,5.LIF无血清无饲养层培养 ,6.大鼠肝细胞 (BRL)条件培养基培养。经体外培养 1 0代后 ,观察其克隆形态 ,同时进行碱性磷酸酶检测并将ES细胞接种于裸小鼠皮下 ,观察ESD3的未分化状态和多潜能性。结果　六种培养体系培养的ESD3具有典型的ES细胞克隆形态 :巢状 (集落状 )隆起生长 ,边缘清楚 ,表面平滑 ,结构致密 ;AKP强阳性 ;裸小鼠体内形成了由多种组织构成的畸胎瘤。结论　六种培养体系均能支持ESD3生长 ,并能保持其未分化性和多潜能性 ,为ES细胞的应用研究奠定了良好的基础。     

高效建立129/ter、C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系的方法学探讨

小鼠胚胎干细胞 (ＥＳ细胞 )是从小鼠囊胚内细胞团(ＩＣＭ)分离出来的、在体外培养过程中可维持未分化状态、正常二倍体核型及无限增殖能力 ,具有多能性或全能性的细胞系[1～ 3 ] 。ＥＳ细胞广泛应用于克隆动物制作、转基因动物生产、动物医学模型建立、真核细胞基因表达与调控的研究、细胞分化机制的探索、人及哺乳动物基因功能的研究以及细胞、组织、和器官的修复与移植研究。胚胎干细胞的研究和应用已成为生命科学研究的热点和前沿领域之一[4～ 8] 。自第一株 12 9小鼠ＥＳ细胞系建立以来 ,人们在生物学和医学等多个领域进行了广泛深入的…     

HDC细胞与MESPU-13细胞形成嵌合鼠能力的比较研究

ES细胞嵌合能力的强弱是人们利用ES细胞获得转基因小鼠时十分关心的问题。本文通过囊胚显微注射法将15个左右ES细胞注入C57 BL/6 J品系小鼠3.5天囊胚的囊胚腔中观察嵌合鼠毛色嵌合情况,统计嵌合鼠的出生率;以及用葡萄糖磷酸异构酶(GPI)电泳法检测ES细胞在嵌含鼠体内各种组织和器官的嵌合情况,对于HPRT缺陷(HDC)细胞和MES-PU-13细胞的嵌合能力我们作了较详细的研究,结果表明MESPU-13细胞嵌合能力较强,而HDC细胞嵌合能力较弱,并讨论分析了这种结果的原因。     

小鼠胚胎干细胞(ES-M_(13))核骨架-核纤层-中间纤维结构体系的研究

本文使用细胞的选择性抽提、DGD包埋去包埋电镜制样、免疫荧光和免疫印迹技术研究了小鼠胚胎干细胞(ES-Ml_(13))的核骨架-核纤层-中间纤维(NM-L-IF)结构体系。在电镜下可以看到,ES细胞存在精细发达的核骨架结构,核骨架纤维同核纤层结构相连接,细胞质中有许多直径为10nm的中间纤维单丝。在免疫荧光分析中,使用角蛋白单克隆抗体有阳性反应,细胞质区域可以看到较强的荧光,没有极性分布现象,也没有观察到纤维状的荧光染色。ES细胞对波形蛋白和结蛋白抗体呈阴性反应,同对照组一样,只能看到非特异性的很微弱的荧光染色。在免疫印迹分析中,使用角蛋白单克隆抗体AF6检测到三条角蛋白多肽,分子量分别为65KD,62KD和52KD。     

BRL条件培养基在ES细胞培养中的应用方法探讨

目的：探讨布法罗大鼠肝细胞条件培养基（Buffalo rat liver cell conditioned medium,BRL）在ES细胞培养中的应用方法。方法：ES细胞复苏后分别培养在BRL条件培养基、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（mouse enbryonic fibroblast,MEF）及合并应用BRL条件培养基和MEF饲养层的环境中,通过细胞计数、拟胚体计数和ES细胞集落边缘细胞分化状态比较ES细胞在三种培养基中生长和分化差异。结果：与BRL组比较,MEF组和BRL＋MEF组细胞生长较快（P＜0.01）,ES细胞集落边缘分化细胞较少;MEF组和BRL＋MEF组无明显差异。结论：在复苏后早期阶段ES细胞培养中,不宜单独应用BRL条件培养基,须用MEF饲养层或合并应用BRL条件培养基和MEF饲养层。     

小鼠胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程中microRNA的变化

目的用生物芯片技术分析胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程中microRNA(miRNA)的表达变化,筛选调控的分化的miRNA,研究分化调控机制。方法胚胎干细胞在含LIF培养基中培养3d后,采用经典5步培养方法定向诱导向神经干细胞分化,采用nestin作为神经干细胞标记进行鉴定,送检胚胎干细胞及神经干细胞,提取总RNA以及小分子RNA,经荧光标记后与miRNA基因芯片杂交,获得胚胎干细胞诱导前后miRNA表达谱。结果1)胚胎干细胞在含LIF培养过程中保持未分化状态,Oct-4、碱性磷酸酶表达阳性;2)经典五步法诱导胚胎干细胞定向分化为神经干细胞,nestin阳性细胞为85%;3)通过基因微阵列分析,有90个miRNA的改变显著,其中68个表达上调,22个表达下调。结论miRNA可能对胚胎干细胞定向分化为神经干细胞过程起到关键作用。     

bFGF诱导MEF生成的条件培养基对人胚胎干细胞生长的影响

为了探讨低浓度bFGF诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）生成的条件培养基对人胚胎干细胞（hESC）生长分化的影响,以系列浓度的bFGF作用于MEF上,收集条件培养基（bFGF—MCM）,用于hES2细胞的无滋养层培养。以不添加bFGF而收集的MEF条件培养基（MCM）为阴性对照．同样浓度的bFGF添加于SR培养基（bFGF—SR）为空白对照。通过形态学特征和碱性磷酸酶染色法对hES2的生长分化状态进行评估。结果发现．培养一周内,未分化hES2克隆的比率,阴性对照为23％：空白对照组为13％-31％。当bFGF浓度为0．1,0．3,1,4ng／ml时,bFGF—MCM组未分化克隆的比率分别为44％,74％,77％和78％,与阴性和空白对照组相比,未分化克隆的比率均有不同程度提高．差异有统计学意义（P〈0．01）。该结果揭示了经bFGF诱导的MEF细胞所产生的条件培养基具备了维持hES细胞正常生长而不分化的能力。对bFGF—MCM的深入分析．有望更好地了解hESC的生长与分化机制。