1-硝基-2-酰基蒽醌-缬氨酸通过抑制ERK1/2激活和ERCC1表达诱导结肠癌细胞死亡

化学方法合成是新药研发的一种重要途径。结合抗肿瘤药物的作用机制以及蒽醌类衍生物的构效关系,设计合成了一类新的蒽醌类衍生物1-硝基-2-酰基蒽醌-缬氨酸(简称C3),发现其具有很好的抗肿瘤活性。为了确定蒽醌类衍生物C3对结肠癌HCT116和HT29细胞的作用及其分子机制,首先通过MTT比色法检测C3对结肠癌HCT116和HT29细胞活性的影响。结果显示,C3对这两种结肠癌细胞具有明显的抑制作用,呈时间和剂量依赖性。60μg/mL的C3处理HCT116和HT29细胞48 h,细胞活性分别是50.67%和59.77%,达到了半抑制浓度;同时,其细胞形态和细胞核发生明显变化。进一步采用Western印迹和qRT-PCR技术,检测C3对DNA切除修复交叉互补1(excision repair cross-complementation group 1,ERCC1)转录水平和蛋白质水平表达及其稳定性的影响。结果表明,C3降低了ERCC1转录水平和蛋白质水平的表达,并且减弱了ERCC1转录水平和蛋白质水平的稳定性。最后,用U0126(MEK1/2抑制剂)和C3联合作用结肠癌HCT116和HT29细胞,通过Western印迹检测ERCC1蛋白质水平的表达。结果表明,C3通过降低p-ERK1/2的蛋白质水平的表达,从而抑制ERCC1的表达。上述结果证明,C3通过细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)信号通路,降低了ERCC1转录水平和蛋白质水平的稳定性,使ERCC1转录水平和蛋白质水平表达发生下调,进而抑制结肠癌HCT116和HT29细胞的活性。     

Discovery of PPi-type Phosphoenolpyruvate Carboxykinase Genes in Eukaryotes and Bacteria

Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) is one of the pivotal enzymes that regulates the carbon flow of the central metabolism by fixing CO₂ to phosphoenolpyruvate (PEP) to produce oxaloacetate or vice versa. Whereas ATP- and GTP-type PEPCKs have been well studied, and their protein identities are established, inorganic pyrophosphate (PP_i)-type PEPCK (PP_i-PEPCK) is poorly characterized. Despite extensive enzymological studies, its protein identity and encoding gene remain unknown. In this study, PP_i-PEPCK has been identified for the first time from a eukaryotic human parasite, Entamoeba histolytica, by conventional purification and mass spectrometric identification of the native enzyme, followed by demonstration of its enzymatic activity. A homolog of the amebic PP_i-PEPCK from an anaerobic bacterium Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii also exhibited PP_i-PEPCK activity. The primary structure of PP_i-PEPCK has no similarity to the functional homologs ATP/GTP-PEPCKs and PEP carboxylase, strongly suggesting that PP_i-PEPCK arose independently from the other functional homologues and very likely has unique catalytic sites. PP_i-PEPCK homologs were found in a variety of bacteria and some eukaryotes but not in archaea. The molecular identification of this long forgotten enzyme shows us the diversity and functional redundancy of enzymes involved in the central metabolism and can help us to understand the central metabolism more deeply.     

敲减MC4R表达对牛胎儿成纤维细胞CMS系统关键因子的影响

为获得敲减黑素皮质素4受体（melanocortin 4 receptor,MC4R）基因的牛胎儿成纤维细胞,并探讨其在能量平衡神经调节系统中的作用,将构建成功并已鉴定为有效序列的短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)真核表达载体pGSH1 GFP MC4R,利用阳离子脂质体转染牛胎儿成纤维细胞并使用G418筛选稳定转染细胞株.利用实时荧光定量和Western印迹检测MC4R及中枢黑素皮质素系统(central melanocortin system, CMS)关键因子的表达水平变化.结果表明,在稳定转染的牛胎儿成纤维细胞系中, MC4R表达显著抑制,瘦蛋白(leptin)和阿黑色素原(POMC)表达下调,黑素皮质素拮抗物agouti相关蛋白(AGRP)和MC3R表达上调,而神经肽Y (NPY)表达无明显改变.综上所述,本研究成功获得了敲减MC4R基因表达的牛胎儿成纤维细胞.相关基因表达水平检测结果提示, MC4R的表达水平对CMS系统中的各关键基因的表达有不同的抑制或促进影响.     

过表达外源ST3Gal I增加MCF-7细胞与胞外基质粘附和侵袭能力

为探讨过表达外源α2,3-唾液酸转移酶（ST3Gal Ⅰ）对乳腺癌MCF-7细胞粘 附和侵袭能力的影响,构建pEGFP-N1-ST3Gal I真核表达载体.采用GenEscortTM Ⅱ包裹后转染MCF-7细胞. MCF-7细胞为3组：未转染组 (M)、转染空质粒组 (P) 和转染ST3Gal I组 (ST3); 荧光显微镜观察融合蛋白EGFP ST3Gal I的表达.采用 半定量RT-PCR、Western印迹法分析转染后MCF-7细胞ST3Gal Ⅰ基因mRNA水平和 蛋白表达水平;流式细胞术分析ST3Gal Ⅰ下游产物细胞表面α2,3-唾液酸含量;采用细胞粘附实验及transwell小室检测转染前后细胞与基质胶Matrigel粘附、迁移和侵袭运动能力的变化.结果表明, 荧光显微镜下P组细胞内绿色荧光呈弥散分 布,而ST3组绿色荧光主要集中在细胞质中,RT-PCR与Western印迹也证实了外源 ST3Gal Ⅰ基因mRNA和蛋白表达均明显增加（P<0.05）,其下游产物细胞表面 α2,3-唾液酸含量明显增加（P<0.05）;与M、P组相比,ST3组表现为粘附、迁移和侵袭能力明显增强（P<0.05）.利用转染技术可明显提高外源ST3Gal Ⅰ在MCF -7细胞表达,明显增加MCF-7细胞与胞外基质（ECM）粘附、迁移和侵袭能力,可形成肿瘤入侵表型,将有望成为治疗乳腺癌转移的新靶点.     

一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因的重组酿酒酵母中,木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH,木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶 NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,是造成木糖醇积累,影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1,与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,提高木糖利用率和乙醇产率.     

鹰嘴豆种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与鉴定

为了寻找具有药物作用的天然胰蛋白酶抑制物,采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析(DEAE-纤维素52)及Sephadex G-100凝胶层析等方法, 从鹰嘴豆种子中分离出一种鹰嘴豆胰蛋白酶抑制剂（CPTI）. 研究表明：CPTI对胰蛋白酶有较强的抑制作用,抑制率达80%,而对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱,抑制率为32%, 对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用; 用SDS-PAGE测得CPTI近似分子质量为25.7 kD; CPTI具有较高的热稳定性,在100 ℃下加热60 min,对胰蛋白酶活性仍保持78%抑制率; Lineveaer-Burk作图得知该抑制剂属竞争性抑制类型. 动力学测定显示,来自鹰嘴豆中的CPTI对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为3.99×10^-7 mol/L.     

DNA损伤反应性蛋白参与中心体调控

中心体是动物细胞有丝分裂期微管组织中心,对于细胞有丝分裂期形成纺锤体、正常分裂及染色体精确分离至关重要. 中心体失调控常造成遗传物质错误分配,最终诱发肿瘤形成.因此,对中心体结构及数量的精密调控将对细胞命运起着决定 作用.目前发现,中心体至少包含100多种调节蛋白,这些蛋白在细胞内的功能各异.最近很多研究显示,多种DNA损伤修复及 应答通路的激酶或磷酸酶定位于中心体,并且参与中心体调控.本文将对中心体结构、中心体复制、中心体分离、中心体扩 增、DNA损伤与中心体异常及DNA损伤反应性蛋白在中心体调控中的功能作一综述.     

PcG蛋白在干细胞调控中的作用

PcG (polycomb group)蛋白作为一种表观遗传修饰系统,在动物和植物中具有 保守性.从功能上讲,PcG蛋白可以分为PRC1（polycomb repressive complex 1）和 PRC2（polycomb repressive complex 2）两个核心蛋白复合体. PRC2含有组蛋白甲 基化酶的活性,而PRC1在泛素连接酶E3介导的组蛋白泛素化中发挥作用,二者通过对 组蛋白的修饰控制靶基因转录. 近来研究表明,PcG蛋白对干细胞数量维持和命运转变 有重要的调控作用,其成员表达失调或缺失导致许多恶性肿瘤的发生或导致植物细胞 丧失分化能力、形成愈伤组织. 本文简要综述了PcG蛋白的组成及其在干细胞调控中 的作用.     

巢蛋白基因沉默通过激活细胞周期依赖性激酶（cdk5）促进大鼠神经胶质瘤细胞C6的迁移和增殖

中间纤维蛋白巢蛋白(nestin)在各种胚胎前体细胞及成熟组织中均有表达.近年一些研究显示,巢蛋白的表达上调和一些恶性肿瘤的病理特征有相关性.但是,巢蛋白在干细胞分化及肿瘤发生中的作用还不为人知.在本研究中,我们运用短发卡状的RNA为工具,以大鼠神经胶质瘤细胞系C6为模型,对巢蛋白的功能进行了研究.划痕实验和迁移实验的结果均显示,巢蛋白基因沉默可以促进C6细胞的迁移.同时,BrdU渗入实验显示,此过程伴随着细胞增殖的增加.进一步研究显示,细胞周期依赖性激酶cdk5的活性在此过程中有显著的增加.此外,巢蛋白基因沉默所引起的迁移改变可以被cdk5特异性抑制剂roscovitine所回复, 而对细胞增殖则没有显著影响.综上所述,本研究揭示了巢蛋白基因沉默与神经胶质瘤细胞的迁移和增殖相关,而cdk5是此过程的重要调节因子.