硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。     

金黄色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z结构域串联体的克隆、表达和筛选

筛选一种高效重组金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)用于制备抗体纯化亲和介质。首先通过基因操作获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因,将目的基因分别克隆至pET-22b表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得不同串联个数的Z结构域基因工程菌,经诱导表达和Ni2+亲和层析纯化得到Z结构域单体和二-五串体蛋白。纯化后的目的蛋白偶联至琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,对人免疫球蛋白G(IgG)进行分离纯化。分析比较Z结构域串联体蛋白产量及其偶联的亲和介质对抗体吸附载量的差异。结果表明,构建的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因工程菌能有效表达目的蛋白,制备的凝胶亲和介质可特异性吸附人IgG。增加Z结构域串联数,重组蛋白产量和单位摩尔数多聚体蛋白吸附载量获得提高,其中,重组四串体蛋白产量大(160 mg/10 g湿菌体),对抗体的吸附载量高(34.4 mg人IgG/mL胶),更适合作为配基用于亲和层析介质的制备。     

重组酶Exo的纯化及多克隆抗体制备

目的:纯化Exo重组酶融合蛋白并制备相应抗体。方法:用阴离子交换柱对蛋白进行初步纯化,然后用Ni-NTA介质填充的层析柱分离纯化含His标签的融合蛋白,用谷胱甘肽琼脂糖4B介质填充的层析柱分离纯化GST融合蛋白;二次纯化的蛋白利用硝酸纤维素膜结合法制备抗原蛋白并免疫实验动物。结果:ELISA结果显示血清抗体效价可达到1∶12 800,说明通过Western免疫印迹自制的多克隆抗体能特异地与Exo重组蛋白相互作用。结论:该蛋白纯化方法操作简单,制备的抗原纯度高,多克隆抗体特异性好。     

抗溶葡萄球菌酶N端合成多肽抗体的制备与鉴定

为了制备抗溶葡萄球菌酶N端合成多肽抗体,合成了溶葡萄球菌酶(lysostaphin)分子的3-13位的11个氨基酸的多肽(THEHSAQWLN),并利用戊二醛双功能试剂将人工合成多肤成功地与KLH进行偶联.免疫新西兰兔制备抗lysostaphin合成多肽的抗体,并经亲和层析进行了纯化.对此抗体进行鉴定的结果表明,抗溶葡萄球菌酶合成多肽抗体可与重组溶葡萄球菌酶分子发生特异性反应,并可用于蛋白免疫印迹.该抗体的制备为使用亲和层析纯化溶葡萄球菌酶提供了有用的配基.     

基于亲和层析方法研究栀子苷的药物靶标

目的:运用亲和层析方法初步探索栀子苷的特异结合蛋白。方法:采用环氧氯丙烷(Epichlorohydrin,ECH)作为活化试剂对琼脂糖凝胶进行环氧基修饰,通过偶联栀子苷与环氧活化的琼脂糖凝胶(epoxy activated Sepharose CL-6B,EAS6B),制备以栀子苷为配基的亲和介质,以高效液相色谱法验证其偶联。利用栀子苷-EAS6B亲和介质,从小鼠脑组织总蛋白中筛选特异结合蛋白。结果:优化偶联条件后,得到最佳的活化反应条件:15%ECH、0.8 mol/L Na OH于37℃反应3 h,环氧基密度达到122μmol/m L,琼脂糖凝胶亲和介质的偶联量为19.53%,偶联率为17.08μmol/m L。从小鼠脑组织总蛋白中筛选得到3个栀子苷特异结合蛋白的条带,经质谱鉴定,发现主要是由热休克蛋白、脑酸溶性蛋白和谷氨酰胺合成酶等组成。结论:确立了琼脂糖凝胶环氧活化的最佳条件,制备了栀子苷-EAS6B亲和介质并应用其筛选出栀子苷的结合蛋白。     

人修饰型降钙素和鼠酰胺化酶基因在昆虫细胞中的偶联表达

人降钙素 (hCT)是 32氨基酸的多肽激素 ,C-端为α脯氨酰胺结构 ,具有调节体内钙、磷代谢等许多重要生理功能。用重组昆虫杆状病毒表达系统 ,偶联表达合成的人修饰型降钙素 (hmCT)基因与GST融合基因和大鼠酰胺化酶 (PAM)基因 ,再用抗hmCT或抗PAM抗体 ,既检测到由昆虫细胞表达的GSThmCT产物也检测到PAM产物。经GSH 琼脂糖凝胶亲和层析 ,分离纯化GSThmCT融合蛋白。这种蛋白修饰酶与底物在真核细胞偶联表达也将适用于其他生物活性肽的体外表达     

亲和层析法纯化霍乱毒素及其B亚单位

利用GM1偶联活化的Sephadex G50或扰CT IgG偶联活化的Sepharose 4B,我们已成功地建立了两种亲和层析纯化CT和CT-B的方法,获得了纯化产品。受体亲和柱对CT-B和CT的分离效率分别为71.6％或48.3％,抗体亲和柱分别为50％或51.7％。纯化产物经SDSPAGE、PAGE分析表明均达到亲和层析电泳纯级。GM1-ELISA、CHO细胞测毒加间接免疫荧光检测、家兔肠段结扎试验和家兔免疫保护试验结果提示纯化产物具有良好的生物学活性。这种有效而简单的方法可推广应用于CT或CT相关毒素的纯化。     

抗牛生长激素单克隆抗体及其免疫亲和吸附柱的制备

我们用杂交瘤技术获得了分秘抗牛生长激素单克隆抗体的细胞系(4B-2)。接种此细胞于小鼠所产生腹水的抗体含量达10mg／ml。经免疫亲和层析方法纯化的单克隆抗体,属1BG1型。将单克隆抗体偶联到Sepharose 4B上,创成了免疫亲和吸附柱,可以从牛垂体匀浆中一步纯化牛生长激素。偶联有50mg单克隆抗体的亲和柱一次可结合3mg牛生长激素。经单克隆抗体亲和层析纯化的牛生长激豢,保持了与兔肝细胞膜受体结合的能力,及在去垂体大白鼠中促进胫骨生长板生长的功能。     

高亲和力抗有机磷杀虫剂单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗有机磷杀虫剂单克隆抗体。采用人工合成带有特殊功能基团的半抗原,将其与载体蛋白偶联,以半抗原偶联物为免疫原,免疫BALBc小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,HAT选择、有限稀释法克隆化,建立分泌抗机磷杀虫剂单克隆抗体的杂交瘤细胞系。ELISA间接法和ELISA竞争抑制法检测抗体滴度,非竞争抑制法检测抗体亲和常数。结果获得9株分泌抗机磷杀虫剂单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其中7株为型特异性,2株为组特异性;Ig亚型均为IgG1;亲和常数为407×108±043M和127×109±024M。结论为人工人工合成的、含特殊功能基团的半抗原,与载体蛋白偶联后,做免疫原,可用于制备高滴度的抗有机磷杀虫剂单克隆抗体,这种单抗可用于机磷杀虫剂残留物的免疫化学检测 。     

用免疫亲和层析法纯化萝卜 PHGPx 天然蛋白

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (RsPHGPx) 是一个定位于线粒体的蛋白质 . 为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的 RsPHGPx. 用重组 RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗 RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组 RsPHGPx 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗 RsPHGPx 的抗体 . 将纯化好的抗体偶联到一个 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗 RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱 . 经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案 . 按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质 . 免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗 RsPHGPx 的抗血清特异识别 . 酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的 PHGPx 活性 . 这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的 RsPHGPx 天然蛋白 . 这是首个关于定位于植物细胞器的 PHGPx 蛋白纯化的报道 . 这一结果为准确测定 RsPHGPx 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物 PHGPx 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究 .     

沙门菌CWDMs脂代谢检测

采用毛地黄皂苷敏感试验和菌细胞胆固醇、甘油三脂及胆碱酯酶定性与定量分析法,检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌经L 型变异后形成的细胞壁缺陷突变株(CW DM )的脂类代谢活性,了解这些CW DM 变异的性质和探讨细菌细胞壁缺陷突变与细菌演变的关系。结果表明,沙门菌CW DM s 具有显著的胆固醇和甘油三脂代谢活性、对毛地黄皂苷高度敏感并且还具有与白色念珠菌相似的胆固醇和甘油三脂的含量,但未能检出胆碱酯酶活性。CW DM s返祖菌丧失了脂类代谢酶类和胞浆膜不含胆固醇,恢复了与其亲代细菌型相似的代谢特征。提示在沙门菌天然即存在有与脂类及胆固醇代谢相关的基因,细胞壁的缺陷导致这些脂类及胆固醇代谢基因活化,以致 CW DM s 能够表达固醇和甘油三脂代谢活性和胞浆膜含有胆固醇     

沙门菌CWDMs乳酸脱氢酶同功酶的观察

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的ＣＷＤＭｓ及其宁代细菌型和伤寒杆菌粗糙型的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同功酶,以了解沙门菌ＣＷＤＭｓ生物氧化的特点和机制,探讨ＣＷＤＭｓ变异的性质。结果表明,伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的细菌型及伤寒杆粗糙型在聚丙烯酰胺凝胶电泳后显示出相同的４种具有不同泳动速率的ＬＤＨ同功酶,但ＣＷＤＭｓ仅显示２种ＬＤＨ。ＣＷＤＭｓ的２种ＬＤＨ同功酶与其亲代细菌型及伤寒杆     

沙门菌CWDMs氨基酸代谢的检测

采用氨基氨利用生长试验和谷丙转氨酶（ＧＰＴ）、谷草转酶（ＧＯＴ）、乳酸脱氨酶（ＬＤＨ）、肌酸激酶（ＣＫ）、α－闳丁酸脱氢酶（α－ＨＢＤ）、γ－谷志肽酶（γ－ＧＴ）,酸性磷酸酶（ＡＣＰ）定性与定量分析法,检测伤ＣＷＤＭｓ变异的特点及其机制,探讨ＣＷＤＭｓ变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。结果表明,沙门菌ＣＷＤＭｓ变异的性质及其与细胞壁缺陷突变的关系。结果表明,沙门菌ＣＷＤＭｓ在仅含蛋氨酸或脯氨     

光照对蕨类植物配子体假根向重力性的影响

对８种蕨类植物配子体假根向重力性反应的研究结果表明,除卷柏Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｔａｍａｒｉｓｃｉｎａ Ｓｐｒｉｎｇ配子体假根无向重力性反应并且其生长方向与光照方向无关外,其它７种的配子体假根均有向重力性反应,并且假根的向重力性反应在配子体发育初期,因光照的方向不同而异,表现为负向光性。随着配子体发育至片状体阶段,光对其向重力性反应的影响逐渐减弱,而重力的影响增强。在蕨类植物配子体发育初期,光对     

中国鳐类脑颅的研究

作者解剖观察了33种,隶于4目、7亚目、15科、19属的中国鳐类脑颅的形态。研究结果认为:锯鳐目和鳐目是原始类群,它们均具吻软骨,其中圆犂头鳐科和团扇鳐科是特化类群。电鳐目亦具吻软骨,它们是特化和退化类群。在较高等的鲼目则无吻软骨。依据鳐类不同的分类阶元,其脑颅亦各具有不同的式型。     

两种蚤的幼虫形态

关于蚤类幼虫形态的研究,进展比较缓慢,我国王敦清1956年首次描述7种蚤的幼虫形态以后,由柳支英,虞以新(1957),孙昌秀(1965),叶瑞玉(1982,1986),费荣中(1986)等学者先后共描述过约29种蚤的幼虫形态。到目前为止,我国已知蚤类幼虫形态约36种,隶属6科19属。本文描述未见报道的无棘鬃额蚤Frontopsylla aspiniformis Liu etWu(1960)和青海双蚤Amphipsylla qinghaiensis Ren et Ji(1979)两种蚤山幼虫形态。