响应面法优化重组hCu,Zn-SOD改构体发酵培养基

目的:优化已构建的重组hCu,Zn-SOD改构体基因工程菌的发酵培养基,提高重组hCu,Zn-SOD改构体活性蛋白产量.方法:单因素实验筛选发酵培养基的碳源和氮源,Plackett Burman设计筛选影响hCu,Zn-SOD活性的重要影响因子,最陡爬坡实验逼近重要影响因子的hCu,Zn-SOD活性的最大响应区域,Box-Behnken及响应分析法进行回归分析.结果:重组hCu,Zn-SOD改构体发酵培养基重要影响因子的最优取值为:酵母提取物7.4646g.L,NaNO3 0.7129g/L,Na2HPO4·12H2O30.4876g/L,KH2PO4 4.1830g/L,优化后的hCu,Zn-SOD活性是1470700U/L,较初始培养基提高了1.04倍.结论:响应面法优化重组hCu,Zn-SOD的发酵培养基提高了hCu,Zn-SOD的活性和产量,为重组hCu,Zn-SOD的工业化生产提供依据.     

曲酸生产菌的复合诱变选育*

以黄曲霉(Aspergillus flavus.)为出发菌株,经3次紫外线、1次^60Co、3次亚硝基胍多重复合诱变处理,选育获得曲酸生产菌UCN7—17,配以最佳培养条件,发酵7d,曲酸产量由原来的0．926％,提高到6．3％。实验证明采用多因子复合诱变,能有效改变菌株对诱变因素敏感性,提高变异率,逐步提高突变株的产酸水平。     

高产β-葡萄糖苷酶N1菌株的分类鉴定

从纳豆中分离纯化得到1株β-葡萄糖苷酶高产菌株,命名为N1菌,利用16S rDNA分析对该菌作了系统进化鉴定.首先提取N1菌基因组DNA,根据不同种属细菌的16S rDNA序列两端的保守性设计通用引物,对N1菌16S rDNA片断进行PCR扩增,对扩增得到的目标片段测序,利用BLAST对测序结果进行比对,构建系统进化树进行分析,初步确定该菌属于枯草芽孢杆菌.研究表明以16S rDNA分析对该菌鉴定完全可行.     

不同生境重楼内生真菌及土壤真菌多样性比较

【背景】植物内生菌的群落组成随物种基因型及不同部位、生长地和环境条件不同而发生变化,而植物相关微生物会影响植物的生长、代谢、化学成分的积累与合成,并且可能对药用植物有效成分的合成造成影响。【目的】通过对不同生长环境重楼内生及土壤真菌群落多样性的研究,寻找园区环境与野生环境的差异真菌,为野生药用植物的人工栽培提供理论基础。【方法】测定两种环境中土壤的理化指标,并采用Illumina HiSeq高通量测序技术分别对野生环境及园区环境中重楼内生及土壤真菌群落转录间隔区ITS进行扩增子序列测定,对不同土壤环境真菌群落组成与多样性差异进行生物信息学分析。【结果】对重楼相关土壤及内生真菌的多样性分析结果显示,野生环境中的真菌丰度及多样性均高于园区环境。其中野生环境与园区环境中根际土壤真菌的丰度有显著性差异(P0.05)。真菌群落注释结果表明,两种环境中分别注释到8个门;在属水平上,野生环境注释到82个属,园区环境注释到78个属;不同土壤环境对微生物群落丰度有着较为显著的差异。野生环境中有4.04%特有的OTU,园区环境中有4.84%特有的OTU。通过LEfSe分析找到了园区环境与野生环境具有显著性差异的生物标记物,Ttracladium marohalianum、Thelephorales和Thelephoraceae为区别两种环境的生物标记物。【结论】野生环境较园区环境在土壤条件上更为疏松,并具有较高的含水量,矿质元素含量也更高,其真菌群落多样性及丰度较园区环境更为丰富。该研究结果将对重楼引种栽培后的质效变迁研究提供理论基础。     

秦岭地区羊肚菌根系土样黏细菌的分离

通过分离陕西秦岭地区羊肚菌根系土样中的黏细菌,建立黏细菌的分离方法,分析羊肚菌根系土样中黏细菌的多样性。采集自陕西商洛地区种植羊肚菌根系土样,采用不同诱导方法分离土样中的黏细菌,比较不同方法的出菌率,通过菌落形态、显微照片对黏细菌进行观察,并结合16S rRNA序列,分析得到的黏细菌种类。采用活的大肠埃希菌作为诱导底物分离出的黏细菌数量最多,本次实验从羊肚菌根系土样中共分离纯化出17株黏细菌,包括5个属,其中黏球菌属(Myxococcus)12株,珊瑚球菌属(Corallococcus)2株,孢囊杆菌属(Cystobacter)1株,原囊菌属(Archangium)1株,标桩菌属(Stigmatella)1株。结果显示羊肚菌根系土壤有黏细菌存在,其中以黏球菌属居多,为后续探讨黏细菌与羊肚菌之间是否存在互生关系提供参考。     

核桃酚类化合物对戊基苯酚免疫毒性的保护作用

目的：分离鉴定对戊基苯酚免疫毒性具有保护作用的核桃酚类化合物成分。方法：用脾淋巴细胞增殖分析实验和酶联免疫吸附试验,检测核桃多酚对戊基苯酚免疫毒性的保护作用;用硅胶层析技术分离核桃多酚;用高效液相色谱—电喷雾—离子阱/飞行时间串联质谱技术鉴定核桃酚类化合物组成。结果：核桃多酚显著抑制戊基苯酚对脾淋巴细胞所致免疫毒性,其中用甲醇和氯仿比例为2∶1的溶液在硅胶层析柱上洗脱的F4组分的免疫保护作用较强,该组分包含67%鞣花单宁和33%黄酮类化合物。结论：保护戊基苯酚免疫毒性的核桃多酚活性成分由5%鞣花酸己糖苷异构体、39%鞣花酸、23%鞣花酸戊糖异构体和 32%槲皮素戊糖苷同分异构体组成。     

金黄色葡萄球菌蛋白A (SpA) Z结构域串联体的克隆、表达和筛选

筛选一种高效重组金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)用于制备抗体纯化亲和介质。首先通过基因操作获得金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因,将目的基因分别克隆至pET-22b表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得不同串联个数的Z结构域基因工程菌,经诱导表达和Ni2+亲和层析纯化得到Z结构域单体和二-五串体蛋白。纯化后的目的蛋白偶联至琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,对人免疫球蛋白G(IgG)进行分离纯化。分析比较Z结构域串联体蛋白产量及其偶联的亲和介质对抗体吸附载量的差异。结果表明,构建的Z结构域单体、二串体、三串体、四串体和五串体基因工程菌能有效表达目的蛋白,制备的凝胶亲和介质可特异性吸附人IgG。增加Z结构域串联数,重组蛋白产量和单位摩尔数多聚体蛋白吸附载量获得提高,其中,重组四串体蛋白产量大(160 mg/10 g湿菌体),对抗体的吸附载量高(34.4 mg人IgG/mL胶),更适合作为配基用于亲和层析介质的制备。     

曲酸产生菌激光诱变效应的研究

采用经紫外线(UV)、^60Co、亚硝基胍(NTG)复合诱变得到的黄曲霉曲酸产生菌(UCN7—12),进行激光诱变处理。研究证实在经过UV、^60Co、NTG诱变处理后,黄曲霉突变株用He—Ne激光与YAG激光进行诱变处理仍能提高产酸率,其中He—Ne激光辐照处理20min,正变率为12．1％,产量提高约13％。YAG激光辐照处理300sec,正变率16．7％,产量提高18．3％。说明上述两种激光对黄曲霉曲酸产生菌有一定的诱变效应。     

一种快速高效获取丝状真菌PCR反应模板的方法

建立一种快速高效获取丝状真菌PCR反应模板的方法,提高丝状真菌PCR鉴定效率。通过单因素法对机械破壁联合微波法进行条件优化,利用优化后的方法获取13株不同种属丝状真菌的PCR反应模板,同时与Chelex-100法、机械破壁法作对比,以试剂盒抽提法作为阳性对照,进行ITS序列扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。机械破壁联合微波法获取丝状真菌PCR反应模板的最佳条件为40 Hz机械破壁1 min、微波700 W高温裂解3 min,采取该法与试剂盒抽提法获得的模板均成功扩增13株不同种属丝状真菌ITS序列,且PCR鉴定结果一致;Chelex-100法获得的模板成功扩增6株丝状真菌ITS序列;机械破壁法获得的模板虽成功扩增9株丝状真菌ITS序列,但扩增效果欠佳。机械破壁联合微波法能够有效获取丝状真菌PCR反应模板,与试剂盒抽提法相比具有操作简便、快速高效的优点,提高丝状真菌PCR鉴定效率。