草鱼生长激素单抗免疫亲和柱的制备及初步应用

用纯化的草鱼生长激素单克隆抗体偶联到CNBr活化的Sepharose4B凝胶上,制成约10ml的亲和层析柱．用该柱一步纯化了重组鲤鱼生长激素基因的表达产物．偶联有13．65mg单克隆抗体的亲和柱一次可纯化得到约0．7mg重组鲤鱼生长激素．酶联免疫受体测定表明它具有强烈的生物学活性,SDS－PAGE表明它为单一蛋白带,分子量约为22000．     

牛生长激素结构不均一性的研究

本文报导用常规方法分离纯化的牛生长激素,在还原性SDS-11％聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈分子量很接近的两条主带(22KD,21.5KD)。用单克隆抗体和多克隆抗体亲和层析技术分析了不同分子量形式的牛生长激素的转化,结果表明:牛生长激素可能在pH5.5条件下转化为21.5KD分子,在pH8.3条件下则转化18KD分子。这几种形式的牛生长激素均保留与抗体的结合力,但亲和力不尽相同,如在亲和层析的洗脱性质上存在差异。已检验分离并部分纯化了18KD分子以备作进一步的研究。     

草鱼生长激素单抗免疫亲和柱的制备及初步应用

用纯化的草鱼生长激素单克隆抗体联剂ＣＮＢｒ活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ凝胶上制成约１０ｍｌ的亲和层析柱,用该柱一步纯化了重组鲤鱼生长激素基因的表达产物。偶联有１３．６５ｍｇ单克隆抗体的亲和柱一次强纯化得到约０．７ｍｇ重组鲤鱼生长激素。酶联免疫受体测定表明它具有强烈的生物学活性,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明它为一蛋白带,分子量约为２２０００。     

牛生长激素cDNA的分子克隆

我们克隆了与牛生长激素Poly(A)⁺RNA互补的DNA(cDNA)。首先从小牛垂体中提纯总的Pply(A)⁺RNA,用AMV逆转录酶合成单链cDNA,以单链cDNA为模板合成双链cDNA,用多聚G及多聚c谱尾法将双链cDNA克隆到pBR322质粒的Pst I位点上,构建成牛垂体PoIy(A)⁺RNA的cDNA文库。以牛生长激素基因为探针,筛选出7个阳性菌落,经电泳鉴定有两个菌落(1号和2号)含有大于500bp的插入片段。1号克隆经酶切图谱、southeTn blot 杂交及序列分析证实含有牛生长激素的编码序列。     

单克隆抗体亲和层析纯化长叶车前花叶病毒

长叶车前花叶病毒上海分离株(HRVsh)单克隆抗体1H2,经纯化后以溴化氰活化法偶联于Sepharose 4B上制成亲和层析柱。HRVsh感染的三生烟提取液,经一次聚乙二醇沉淀初步纯化,悬浮液上亲和层析柱,于磷酸缓冲液中吸附,蒸馏水洗脱。收集的病毒制剂接种心叶烟有感染性,电镜观察见典型的HRVsh粒子,紫外吸收光谱与常规方法提纯的病毒相似,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈一条带。结果表明单克隆抗体亲和层忻得到高度纯化的HRVsh。最后讨论了单克隆抗体亲和层析方法的优点。     

鲤鱼（Cyprinus carpio）血清生长激素变化的酶联免疫吸附测定

本研究的目标是纯化鲤（Cyprinus carpio）生长激素,用于制备抗鲤鱼生长激素的单克隆抗体,建立鲤鱼生长激素的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA）技术,并用所建立的技术检测不同环境下养殖的鲤鱼的血清生长激素水平的变化．利用柱纯化技术纯化酵母表达草（Ctenopharyngodon idella）生长激素,免疫新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）,获得抗草鱼生长激素多克隆抗体．摘取鲤鱼垂体,从中提取生长激素,经层析纯化后,以变性聚丙烯凝胶电泳判断其分子量和纯度,并利用抗草鱼生长激素多克隆抗体以Western blot验证．纯化并经鉴定的鲤鱼生长激素作为免疫原被用于B淋巴细胞杂交瘤技术．共建立14株能够稳定分泌抗鲤鱼生长激素单克隆抗体的杂交瘤细胞系（FMU-cGH1-FMU-cGH14）,其中8个克隆（FMU．cGH1～FMU-cGH6,FMU-cGH12和FMU-cGH13）成功用于Western blot分析,9个克隆（FMU-cGHl-FMU-cGH7,FMU-cGH9和FMU-cGH10）可用于荧光标记和免疫组织化学分析．利用竞争性ELISA进行表位分析,结果表明这些单克隆抗体能够识别5个不同的表位．利用其中的FMU-cGH12作为包被抗体,FMU-cGH6作酶标抗体,建立了能够检测鲤鱼生长激素含量的ELISA技术．这一检测系统被证明具有高度的稳定性和灵敏度,能够检测并定量低至70pg／mL的生长激素．利用这一检测技术,发现限制进食和网箱养殖的鲤鱼其生长激素含量都有明显提高,分别为对照的6．9和5．8倍,显示不同生长环境下鲤鱼生长激素水平具有不同的反应．     

双抗体免疫沉淀法纯化牛生长激素poly(A)~+RNA的研究

我们用双抗体免疫沉淀法,从牛垂体多聚核糖体中分离出牛生长激素特异多聚核糖体,由此多聚核糖体纯化的牛生长激素Poly(A)~+RNA,可以在麦胚体外翻译系统中和兔网织红细胞体外翻译系统中促进~(14)C-亮氨酸的参入。合成的含~(14)-亮氨酸的翻译产物中有91％可以被牛生长激素抗体沉淀。用SDS-11％PAGE对翻译产物进行鉴定表明,翻译产物在25KD处呈一条放射自显影带,与报导的牛生长激素前体分子量相吻合。     

重组人β-干扰素的表达、纯化与鉴定

经 1 5L发酵罐制备重组人β 干扰素 (recombinanthumanIFN β,rhIFN β)。以免疫亲和层析方法纯化发酵液中rhIFN β并与蓝谱亲和层析纯化法比较 ,探索快速高效纯化rhIFN β的方法。以ELISA测定rhIFN β含量及经免疫亲和层析纯化的rhIFN β中鼠IgG残留量 ;以PAGE法鉴定rhIFN β的分子量 ;以CPEI法测定rhIFN β的生物活性。取 2L发酵液经免疫亲和层析纯化后 ,得到 3.0 3mgrhIFN β ;经蓝谱亲和层析纯化后 ,得到2 .6 5mg ;分子量为 2 2kD ;沉淀带灰度值分别为 96 .2 %和 95 .1 % ;CPEI比活性分别为 1 .4 3× 1 0 7IU/mg和 1 .6 3× 1 0 7IU/mg ;经免疫亲和层析后纯化物中鼠IgG残留量小于 5 0 μg/L。实验结果表明 ,所采用的免疫亲和层析和蓝谱亲和层析均可快速高效地从酵母菌发酵上清液中分离纯化rhIFN β基因产物     

基因工程生长激素研究进展

基因工程生长激素研究进展马昭若（中国专利局１０００８３）生长激素是一种由动物的脑垂体产生并分泌的蛋白质激素。生长激素促进骨骼生长、氮保留和蛋白质合成,并影响葡萄糖与脂类代谢。历史上,一般都是从切除的垂体组织中分离纯化生长激素［１］。八十年代初以来,随着重组ＤＮＡ技术的产业化,已可以由微生物大量产生各种来源不含其他杂蛋白的生长激素［２－３］。     

无牛血清IgG细胞培养基（—GFCS培养基）的制备及其在杂交瘤细胞体外培养中的应用

为了制备不含牛血清IgG的细胞培养基（－GFCS培养基）,并研究其在杂交瘤细胞体外培养中的应用,采用蛋白G亲和层析的方法,将含有血清的细胞培养基中的牛血清IgG去除,以制备无IgG的培养基。使用该培养基体外培养杂交瘤细胞后,监测细胞生长和上清抗体浓度。对培养上清中的IgG类单克隆抗体可以采用蛋白G亲和层析进行纯化。与示去除牛血清IgG的培养基相比,－GFCS培养基培养的杂交瘤细胞的生长状况及上清抗体浓度均无明显变化;从－GFCS培养上清中成功纯化出不被血清IgG污染的IgG类单克隆抗体,本文结果表明,采用－GFCS培养基体外培养分泌IgG类单抗的杂交瘤细胞,可以简化上清抗体的纯化工艺。     

牛生长激素抗体的制备及其纯化

 <正> 生长激素是垂体前叶分泌的蛋白质类激素,它在体内有多种生物学效应。近年来,对生长激素的作用机理及生长激素基因工程的研究报道很多,国内也开始了这方面的工作。我们实验室从1984年开始进行牛生长激素基因工程的研究。在这项研究中,为获得牛生长激素基因的探针,首先需要有高纯度牛生长激素mRNA。双抗体免疫沉淀法是分离、纯化特异mRNA的有效方法,采用这种方法分离牛生长激素(bGH)mRNA,需要有高纯度bGH抗体。此外,高纯度牛生长激素抗体对于检测生长激素cDNA在细菌中的表达,对于制备亲和层析     

单克隆抗体亲和层析柱在纯化羊垂体催乳素中的应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术制备出5株抗羊垂体催乳素单克隆抗体。以羟磷灰石柱层析纯化一种单克隆抗体2D2(属IgG₂a)。与环氧氯丙烷活化的sepharose 4B偶联制备免疫吸附层析柱。以此免疫吸附柱从羊垂体粗提液中简单快速地纯化了催乳素。     

草鱼生长激素非竞争式酶联免疫吸附测定法的建立及鉴定

应用草鱼生长激素（ｇｃＧＨ）单克隆抗体及多价兔抗血清建立了草鱼ＧＨ非竞争式酶’联免疫吸附测定ＥＬＩＳＡ系统。用正辛酸法对腹水单抗进行了分离纯化,获得了高纯度的单抗制备物。聚丙烯酸胺凝胶电泳表明纯化的单抗由分子量分别为５５ｋＤ和２５ｋＤ的两条蛋白带组成。用纯化单抗铺底,用兔抗血清作后续抗体建立了一种测定草鱼ＧＨ的非竞争式双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。交叉试验表明该测定系统只与草鱼ＧＨ和基因重组鲤生长激素（ｒｃＧＨ）具有剂量依存的结合反应,而与大马哈鱼生长激素（ｓＧＨ）、牛生长激素（ｂＧＨ）、大马哈鱼促性腺激素（ｓＧｔＨ）、及黑鲢促性腺激素（ｂｓｃＧｔＨ）等均无交叉反应。该 ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度可达０．８ｎｇ／ｍｌ,组内变异系数为 ５．９ ％,组间变异系数为７．６％,回收率达９０％以上。初步应用表明,鲤和团头鲂垂体抽提液、草鱼血清、鲤血清及鲫血清在该测定系统中有剂量依存的反应曲线,而大口鲶、黄颡鱼、中华鲟及黄鳝鱼垂体抽提液及大口鲶、胡子鲶和罗非鱼血清在该测定系统中没有交叉反应。     

分泌型重组人生长激素工程菌发酵及其产物纯化

在 5L发酵罐中将工程菌pET-ompA3-hGH/BL21(DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 250mg/L ,占周质蛋白的 44%～ 54% ,发酵周期缩短为8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到96%以上 ,纯化产物在分子质量大小、免疫活性和二硫键的形成与天然生长激素相一致 。     

大鳞大马哈鱼垂体生长激素的分离、纯化与鉴定

应用ConA-Sepharose 4B亲和层析、凝胶过滤及离子交换层析等技术从大鳞大马哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)垂体中分离纯化了具有生物活性的生长激素(sGH)。用放射受体测定法(RRA)检测sGH组分的生物活性,结果表明纯化的8GH制品具有与兔肝细胞GH受体结合的生物活性。用放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)分别检测了另两种垂体激素-催乳激素(PRL)和促性腺激素(GTH)在纯化的sGH制品中的残留量均在0.5％以下。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE评价sGH制品的电泳纯度并测定了其分子量为22000左右。等电聚焦电泳表明该种鱼GH由等电点分别为6.3和6.6的两种形式的分子组成。     

生长激素结合蛋白

动物的生长调控作用中垂体分泌的生长激素 (ＧＨ)起着重要的作用。ＧＨ的生理调控作用的发挥又与血液中的生长激素结合蛋白(ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＨＢＰ)以及靶细胞膜上的生长激素受体 (ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｒｅ ｃｅｐｔｏｒ,ＧＨＲ)的作用不可分割。这三者以及下丘脑的生长激素释放因子 (ＧＨｒｅｌｅａｓｅｆａｃ ｔｏｒ ,ＧＨＲＦ) ,还有垂体的生长抑素 (ｓｏｍａｔｏ ｓｔａｔｉｎ ,ＳＳ)等共同构成动物的内分泌生长轴(ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｃａｘｉｓ) ,对动物的生长发育起着决定性的…     

生长激素和生长激素受体的分子生物学

1 .生长激素的结构生长激素 (ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ ,ＧＨ)一般含有 1 91个氨基酸 ,约 2 2ｋＤ。猪与牛的ＧＨ氨基酸序列具有高度的同源性 (约 90 % ) [1] 。猪和牛的ＧＨ对人没有促进生长的作用 ,可能是猪和牛ＧＨ对人的生长激素受体(ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ ,ＧＨＲ )的结合亲和性低于人ＧＨ对人ＧＨＲ的结合亲和性的缘故。ＧＨｍＲＮＡ翻译的初级产物是前生长激素 ,它比成熟ＧＨ在Ｎ端多出 2 6个氨基酸残基的疏水信号肽[2 ] 。通过Ｘ射线衍射技术等研究发现 ,ＧＨ由 4个螺旋组成 ,自Ｎ端至Ｃ端依次为螺旋 1～ …     

猪生长激素及其单克隆抗体的制备与纯化

本文介绍一种简便快捷提纯猪生长激素的方法。通过杂交瘤技术,首次获得抗猪生长激素的单克隆抗体,并讨论和比较从腹水纯化单克隆抗体的各种方法。     

鲈鱼生长激素的分离及其生物活性鉴定

运用葡聚糖凝胶Ｇ－１００过滤和反相高儿液相色谱纯化两步法,首镒从鲈鱼脑垂体中分离出鲈鱼生长激素,通过ＳＤＳ－聚丙烯凝胶电泳测得鲈鱼非还原性的和还原性的生长激素分子量分别为１９．２和２０．７ｋＤ;等电聚焦证实鲈鱼生长激素等电点为７．１５。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹反应证实,鲈鱼生长激素具有与大麻哈鱼生长激素抗体发生特异性免疫交叉反应的特性,而与大麻哈鱼催乳素和生长催乳素抗体无免疫交叉反应。     

青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素（GH）成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。