构建抑制NF-кB信号通路的药物筛选模型

NF-кB已被证明在肿瘤和炎症过程中起到至关重要的作用.因此,建立抑制NF-кB信号通路的药物筛选模型至关重要.利用荧光素酶报告基因技术与蛋白印迹技术分别探索TNFα处理浓度及时间对NF-кB报告基因表达和NF-кB抑制亚单位IкBα降解的影响,进而构建NF-кB信号通路抑制剂药物筛选模型.实验结果表明,0.01 nmol/L TNFα作用24 h即能刺激HEK293T细胞中NF-кB报告基因较高水平的表达,且其表达量与TNFα的剂量和处理时间呈正相关性;0.01 nmol/L TNFα作用5 min即能使Pane-28细胞中IкBα明显降解,20min～30 min几乎降解完全,之后IKBa含量又开始增加.NF-кB阳性抑制剂藤黄酸验证表明NF-кB萤光素酶报告基因检测筛选体系和NF-кB抑制亚单位降解筛选体系两种体系稳定可行.结果证明,两种模型可以用于NF-кB信号通路抑制剂药物的筛选.     

遍在蛋白调节NF—кB信号转导通路的研究进展

NF-кB信号通路参与了多种基因的转录调控和很多重要的生理和病理过程,遍在蛋白在其中的不同的阶段发挥了不同的作用。一方面通过遍在蛋白化IкB,促使其被26S蛋白酶体识别而降解,从而释放出NF-кB进入核内,调控相应基因的表达;另一方面通过遍在蛋白化TRAF6来激活TAK1,然后进一步活化IKK,后一种途径为了解NF-кB信号通路的调控提供了新的线索,并为遍在蛋白功能的研究开辟了新的方向。     

NF-κB与肿瘤发生及药物筛选

NF-κB是一类能特异性地识别结合DNA的Rel类蛋白质二聚体转录因子。在静息细胞中 ,NF-κB与抑制性蛋白IκBs结合形成复合物 ,并被滞留于细胞质中而处于非活化状态 ;当细胞受到各种胞内外刺激时 ,IκBs被迅速地降解 ,NF-κB得以释放并进入细胞核 ,从而发挥其转录调节功能。NF-κB通过调控众多靶基因的转录表达而在免疫、炎症反应、细胞增殖与凋亡及肿瘤发生等许多生理学过程中发挥重要作用。介绍了NF-κB活化的调控机制 ,并对NF-κB信号通路在肿瘤发生等相关过程及其在药物筛选中的作用进行了探讨。     

NF-κB家族特征及其调控途径和生物学功能

NF-кB(nuclear factor-кB)广泛存在于机体细胞中,与细胞对外界刺激的应答、细胞生长、分化、发育、凋亡、粘附及炎症反应密切相关,是一类重要的转录调节因子。本文结合近年来的研究进展,对NF-кB家族成员、NF-кB活化及调控途径,以及NF-кB生物学功能作一综述。     

鼻息肉中NF-κB的活化对IL-8转录的影响及意义

目的 通过检测鼻息肉组织中核因子кB(NF-кB)的活化及白介素-8(IL-8)的转录水平,探讨鼻息肉组织中NF-кB的活化对IL-8转录的影响及临床意义.方法分别应用凝胶电泳迁移实验法、蛋白免疫印迹法、免疫组织化学法及逆转录聚合酶链反应法检测47例鼻息肉患者(鼻息肉组)的息肉组织中NF-κB的活性及其p65亚基蛋白水平、IL-8的组织定位及转录水平;以22例鼻中隔手术患者中鼻甲黏膜组织作为阴性对照(对照组);对NF-кB的活性及其p65亚基蛋白水平与IL-8的转录水平进行Pearson's相关性分析.结果 EMSA测得鼻息肉组患者息肉组织中NF-κB的活性(216.51±17.33)较对照组(63.57±5.26)显著增高(P<0.01);Western Blot 测得鼻息肉组NF-κB亚基p65 蛋白的水平(153.72±9.15)较对照组(73.92±6.74)显著增高(P<0.05);半定量RT-PCR 测得IL-8 mRNA的转录水平(0.95±0.08)也显著高于对照组(0.23±0.03)(P<0.05);Pearson's相关性分析结果提示:鼻息肉组患者息肉组织中NF-κB的活性及其p65亚基蛋白水平与IL-8的转录水平呈显著正相关性(r值分别为 0.78 & 0.53,均P<0.01).结论 IL-8是鼻息肉组织中NF-кB激活后所分泌的重要的炎性细胞因子,NF-кB和IL-8引起的局部微环境的改变可能是鼻息肉发病的重要因素.     

凋亡相关的斑点样蛋白ASC

与凋亡相关的斑点样蛋白ASC是一种含胱天蛋白酶募集域和热蛋白样结构域的蛋白质,它与NF-кB、胱天蛋白酶-1(caspase-1)和热蛋白(pyrin)等多种分子有关,在炎症、细胞凋亡和肿瘤等方面发挥重要作用。     

遍在蛋白调节NF-кB信号转导通路的研究进展

NF-κB信号通路参与了多种基因的转录调控和很多重要的生理和病理过程。遍在蛋白在其中的不同的阶段发挥了不同的作用。一方面通过遍在蛋白化IκB,促使其被26S蛋白酶体识别而降解,从而释放出NF-κB进入核内,调控相应基因的表达;另一方面通过遍在蛋白化TRAF6来激活TAKI,然后进一步活化IKK。后一种途径为了解NF-κB信号通路的调控提供了新的线索,并为遍在蛋白功能的研究开辟了新的方向。     

NF-κB信号转导通路对细胞周期的调控

核转录因子NF-κB是哺乳动物Rel蛋白家族成员,属DNA结合蛋白,具有结合某些基因启动子κB序列并启动靶基因转录的功能。静息状态下,NF-κB二聚体在胞浆肉没有活性,当细胞受刺激后,它在NF-κB信号转导通路的上游激酶级联作用下被激活,并易位到细胞核内,增强靶基因表达。NF-κB是细胞分裂和生存的关键调节因子,参与调控细胞周期、细胞增殖和细胞分化。现就NF-κB对细胞周期的影响作一综述,着重阐述NF-κB通过细胞周期蛋白和CDK／CKI作用G1/S期检测点、G2/M期检测点,调控细胞周期进程。     

脂多糖激活靶细胞NF-κB的机制与途径的研究进展

真核细胞核转录因子Rel/NF-κB是近年来发现的一类具有多向性转录调控作用的蛋白质因子,广泛调控着自昆虫至人类的免疫和炎症反应中一系列基因的表达,静息时,Rel/NF-κB二聚体与其抑制蛋白IκB结合成三聚体存在于胞质中,胞外刺激通过不同的信号转导途径使IκB降,解,活化的NF-κB进入核内发挥功能,本文主要介绍了脂多糖激活靶细胞NF-κB的分子机制及酷氨酸蛋白激酶,丝裂原激活的蛋白激酶,蛋白激酶C等相关胞内信号转导途径的研究进展。     

核转录因子-κB信号通路的激活与阻断

核因了-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）是广泛存在于细胞内的一种重要的核转录因子.它参与机体的炎症反应、免疫应答、细胞凋亡及其他应激反应.NF-κB过度激活与人类许多疾病如类风湿性关节炎、肿瘤和移植排斥反应等直接相关,因此通过药物或者分子生物学方法来抑制或者阻断NF-κB信号转导途径可能会成为治疗某些疾病的重要手段.该文介绍NF-κB的生物学特性及各种阻断NF-κB活化的策略.     

大气可吸入颗粒物造成肺损伤的NF-κB研究进展

NF-κB信号通路在大气可吸入颗粒物（PM10）对肺的损伤过程中起到重要的作用,但NF-κB信号通路参与的损伤机理尚不清楚。本文对NF-κB的结构与组成、颗粒物中NF-κB的激活因素、激活过程和抑制剂的相关研究等内容做简要综述。     

脂氧素对粒细胞集落刺激因子表达的影响及其机制初探

体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,实验分为空白组、脂多糖(LPS)组(1mg/LLPS)及脂氧素A4(LXA4)处理组(1mg/LLPS与0.1~1000nmol/LLXA4共同温育)。处理预设时间后,实时荧光定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附实验分别检测粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因表达和蛋白质分泌水平,免疫印迹法检测IκBα降解和NF-κB转位情况,荧光素酶报告质粒检测NF-κB转录活性。结果表明:LPS诱导G-CSF表达(P<0.01),LXA4抑制G-CSF基因表达和蛋白质分泌,其中10nmol/LLXA4作用最明显(抑制率为39.8%)(P<0.01);10nmol/LLXA4明显抑制IκBα降解(P<0.05)、NF-κB转位(P<0.05)以及NF-κB的转录活性(P<0.05)。这提示LXA4可能通过抑制NF-κB的转位和转录活性而抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌G-CSF。     

红花桑寄生总黄酮提取物增强多柔比星抗白血病效果及其相关机制研究

以人急性髓系白血病细胞株HL-60裸鼠移植瘤为模型,研究了一种寄主为夹竹桃的红花桑寄生总黄酮提取物(Nispex)与多柔比星联用的抗白血病效果及其可能的作用机制.以抑瘤率为指标,采用药物相互作用指数(CDI)来评价药物联合作用疗效.10 mg/ks/d Nispex腹腔给药(连续给药9 d)与15 mg/kg多柔比星(尾静脉一次性给药,下同)联用对HL-60移植瘤有较好的抑制作用,抑瘤率89%,CDI为0.43(P<0.01);与10 mg/kg多柔比星联用,抑瘤率为57%,CDI值为0.80(P<0.05).说明Nispax与多柔比星有较好的协同抗白血病作用.采用EMSA、Western blot和免疫荧光染色分析了Nispex对HL-60细胞中NF-кB的影响,结果表明Nispex可降低了NF-кB的DNA结合活性,下调NF-кBp65蛋白的表达,也抑制NF-кB的核转移,说明Nispex是一种天然NF-кB抑制剂.ELISA分析表明Nispex可下调HL-60细胞分泌VEGF.     

精氨酸甲基转移酶1和核因子кB在哮喘豚鼠中的表达变化

目的:探讨共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1和核因子-кB在豚鼠支气管哮喘模型气道和肺组织的表达变化.方法:24只白色雄性豚鼠随机分为:①正常对照组;②哮喘组.卵清蛋白致敏并激发后采用间接免疫荧光法检测气道及肺组织精氨酸甲基转移酶1和核因子NF-кB(P65)的表达水平,探讨其在哮喘中可能的作用机制.结果:CARM1和NF-кB(P65)在对照组和哮喘组均有阳性表达,主要在支气管-终末细支气管上皮细胞和肺组织成纤维细胞胞核表达.正常对照组和哮喘组CARM1和NF-кB(P65)的表达差异均有统计学意义.结论:在哮喘豚鼠气道上皮及肺组织CARM1和NF-кB(P65)在细胞胞核高表达,提示CARM1可能通过增强募集NF-кB到相关位点激活NF-кB信号转导通路,并启动了多种前炎性基因和免疫调节基因的转录激活从而诱发哮喘炎症反应.     

核因子кB与动脉粥样硬化新进展

动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是一种炎症性病变,它以血管壁上巨噬细胞源性的泡沫细胞和大量趋化因子、细胞因子和生长因子堆积为主要特征.这些因手调节着固有细胞的迁移、分化和转归,最终影响动脉粥样硬化斑块形成,其中一个关键的调节因子就是转隶因子核因子-кB(NF-кB).过去它都被一直认为是一个促进动脉粥样硬化的因子,主要是由于它调节许多与动脉粥样硬化有关促炎基因的表达.最近有文献报道说NF-кB有可能在促炎、抗炎、细胞的生存和增值方面巧妙地监护着动脉粥样硬化过程的平衡.因此,本文就NF-кB与动脉粥样硬化病变有关的启动、泡沫细胞的形成、炎症、免疫、平滑肌细胞增值、纤维帽形成、细胞凋亡关系的新进展作一综述.     

NF-κB与持久炎症及肿瘤发生关系

NF-κB是一种序列特异性转录因子.早先的研究证明其主要功能是参与炎症反应和天然免疫应答.最近的研究发现,某一部位的持久炎症反应将导致NF-κB信号通路组成性持续激活,导致NF-κB靶基因的异常表达,这些基因的异常表达往往与肿瘤的发生、转移、组织浸润以及肿瘤细胞的抗凋亡作用相关.因此,将NF-κB作为靶向分子,抑制其活性已成为肿瘤防治的研究热点和新的思路.     

NF-κB荧光素酶报告基因系统的构建及验证

为了定量检测NF-κB的活化效果及筛选与NF-κB活化调控相关的药物,通过去除逆转录病毒载体pQCXIP原有的CMV启动子,并分别插入NF-κB增强子序列及荧光素酶NanoLuc报告基因序列,构建了一种新的含有NF-κB增强子序列和NanoLuc(NLuc)报告基因序列的表达载体,并进一步建立受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系。酶切鉴定及测序结果表明成功构建了重组质粒pQCXIP-NF-κB-NLuc;NF-κB信号通路的刺激物肿瘤坏死因子TNF-α作用于构建的稳定表达NLuc的细胞系后出现特异性的荧光素酶反应,且该酶反应与TNF-α的刺激呈良好的时间、剂量依赖性,该结果表明受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系构建成功。实例验证中,NF-κB抑制剂雷公藤甲素对此细胞系NLuc荧光素酶表达的抑制呈剂量效应。综上,本实验构建的受NF-κB调控的稳定表达NLuc荧光素酶的报告基因系统可用于NF-κB的活化效果的定量检测及筛选与NF-κB活化调控相关的药物,具有研究和应用价值。     

乳腺癌中NF-κB蛋白表达及其与TNF-α相关性研究

目的：研究乳腺癌中细胞核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）的表达及其与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα,TNF-α）的相关性。方法：采用免疫组织化学的方法检测67例原发乳腺癌组织中NF-κB和TNF-α的表达,检测NF-κB在癌旁正常组织、乳腺增生和乳腺癌中的表达情况,并分析NF-κB的表达与乳腺癌临床病理特征的关系以及NF-κB与TNF-α的相关性。结果：1）NF-κB在癌旁正常组织、乳腺增生和乳腺癌中表达的阳性率分别为20%（3/15）、33.3%（5/15）、79.1%（53/67）;2）NF-κB的表达与年龄、肿瘤大小、组织学类型均无相关性（P〉0.05）,与淋巴转移的有无及组织学分期有显著相关性（P〈0.05）;3）NF-κB的表达与TNF-α呈显著正相关（P〈0.05）。结论：乳腺癌中NF-κB的表达显著增加且与其淋巴转移的有无及肿瘤组织学分期有显著相关性,与TNF-α呈显著正相关,对乳腺癌良恶性判断、诊断、靶向治疗及预后提供重要参考依据。     

丙丁酚对oxLDL诱导血管内皮细胞增殖抑制的保护作用

目的:探讨丙丁酚(普罗布考)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用,以及时NF-κB和Iκ B-α表达的调节作用.方法:MTT法分别检测oxLDL不同浓度(1 g/ml、10 g/ml、100 g/ml)处理HUVEC不同时间(12h、24h、48h)细胞增殖情况;5 g/mL丙丁酚预处理HUVEC 24小时,MTT检测细胞增殖情况;western blot检测oxLDL处理细胞及丙丁酚预处理后NF-κB和Iκ B-α蛋白表达水平.结果:oxLDL处理HUVEC细胞24小时后,对细胞增殖具有抑制作用,Western blot结果显示NF-κB表达显著上调,Iκ B-α蛋白表达下调.而用5ug/mL丙丁酚预处理可以明显缓解细胞增殖抑制,NF-K B和Ig B-a蛋白的表达也恢复至正常水平.结论:丙丁酚可显著缓解oxLDL诱导的HUVEC细胞增殖抑制,并且NF-κ B和Iκ B-α表达的改变可能参与此过程.