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Neurturin嵌合神经营养因子重组腺病毒的构建及体外活性测定 总被引:2,自引:1,他引:1
Neurturin是神经营养因子家族成员,研究发现体外表达的重组Neurturin能够促进多巴胺能神经元的存活,对帕金森氏病的基因治疗有重要意义。但有研究指出野生型Neurturin在细胞中不能完成加工进而不能被分泌到胞外。因此实验对野生型Neurturin进行改造,将NGF的信号肽与Neurturin的成熟肽进行拼接,形成一种嵌合的NGF/NTN基因,并将该基因插入重组腺病毒基因组中,在AD-293细胞中包装获得重组腺病毒。通过免疫荧光和Western blotting证实Neurturin能够在胞内表达,并且能够对其进行加工最后分泌至胞外。最后通过鸡胚背根神经节培养实验证明该嵌合基因能够表达具有明显活性的Neurturin。 相似文献
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目的:通过靶向抑制原癌基因Bmi-1表达,观察其诱导胆囊癌细胞凋亡及上调Caspase-3蛋白表达的效应,探讨其在胆囊癌形成中的机制。方法:通过前期成功构建miRNA-Bmi-1重组质粒转染GBC-SD细胞,然后将其分为miRNABmi-1、miRNAScramble、Lipofectamine、GBC-SD 4组,转染48h后采用RT-PCR和Western blot法检测各组Bmi-1mRNA和蛋白的表达,倒置显微镜观察细胞生长情况;流式细胞技术检测细胞的凋亡率、细胞周期分布及Caspase-3蛋白表达水平。结果:RT-PCR和Western blot结果显示miRNABmi-1组细胞Bmi-1 mRNA和蛋白的表达水平明显低于对照组(P0.05)。倒置显微镜观察显示miRNABmi-1组细胞死亡较对照组明显;细胞周期检测显示:miRNABmi-1组细胞阻滞于G0/G1(72.20±1.71),G2/M和S期细胞减少(18.30±7.21,9.50±6.01),凋亡指数增高(49.83±5.19),Caspase-3蛋白表达量明显增加(30.37±8.10),与对照组比较,具有显著性差异(P0.05)。结论:靶向沉默Bmi-1能有效抑制胆囊癌细胞Bmi-1mRNA及蛋白表达,诱导胆囊癌细胞凋亡,其机制可能是早期使胆囊癌细胞周期阻滞于G0/G1期,并上调了Caspase-3蛋白表达,Bmi-1可能参与调控线粒体依赖的凋亡途径。 相似文献
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凋亡素由鸡贫血病毒中的VP3基因编码,能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。以真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,最终纯化后的抗体效价可以达到1 ∶ 243 000。用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染细胞后对抗体的特异性进行免疫学评价。首先利用免疫荧光技术检测VP3基因在人膀胱癌细胞株T24、EJ细胞以及Vero细胞中的表达情况,观察到凋亡素在T24、EJ细胞中主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质。其次通过Western blotting检测纯化后的抗体能与细胞内腺相关病毒介导表达的凋亡素蛋白特异性结合。实验证明了制备的凋亡素蛋白多克隆抗体的有效性和特异性,为进一步阐明凋亡素抗肿瘤效应的分子机制及生物学特性奠定了基础。 相似文献
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