猪垂体中猪生长激素基因的克隆和部分序列分析

从猪垂体中提取出DNA,以EMBL3噬菌体作裁体,构建了染色体基因文库。用全长的猪生长激素(pGH)cDNA作探针,经原位杂交,筛选出5个阳性克隆。提取其中一个阳性克隆的DNA,通过斑点杂交,酶解和Southern印迹,表明它含有全长猪生长激素基园,将sma Ⅰ酶解后soufhem印迹为阳性的两个片段进行了亚克隆,对其中含有猪生长激素基因sma Ⅰ位点上游序列的片段进行了部分序列分析,并和已发表的相应序列进行了比较。     

牛和猪的生长激素在细菌中高效率表达

用垂体的Poly(A)mRNA制备的cDNA含有牛和猪生长激素(bGH,pGH)编码序列,并在细菌中克隆。由各自cDNA的核苷酸序列而得知的肽激素的一级结构大约有90％的同源性。为了组建能在细菌中高效产生成熟的动物生长激素的表达质粒,利用合成DNA的方法来修饰克隆的cDNA。     

鲑鱼生长激素cDNA的分子克隆和序列分析

从太平洋切奴克鲑鱼(Pacific Chinook Salmon,Oncorthychus tschawytscha)垂体poly(A)~+ RNA构建cDNA文库。按照鲑鱼生长激素(sGH)部分氨基酸序列合成两个寡聚脱氧核苷酸探针,它们分别与编码第1—7和第166—172氨基酸序列互补。用探针筛查cDNA文库,得到了完整的sGH cDNA克隆。cDNA序列已测定,包括编码210个氨基酸的编码序列。其中含有22个氨基酸的信号肽序列和188个氨基酸的成熟GH序列。该克隆还包括了5'端和3'端非翻译区,分别为72个和438个碱基对长。与Chum鲑鱼比较表明,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为97%和99%。     

猪生长激素cDNA在芽孢杆菌中的表达

利用随机克隆的枯草杆菌启动子-信号序列构建茅孢杆菌分泌载体pUS186。用限制酶将切除了信号序列的猪生长激素cDNA从质粒pLY3-PGH 604切下,亚克隆至pUS186,并在该cDNA的下游接上地衣杆菌α-淀粉酶基因的转录终止子,构建猪生长激素表达质粒pSGH 1864,将此质粒转化蛋白酶双缺陷的枯草杆菌DB104及短小茅孢杆菌289。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检出在发酵上清液中多出一条22kD的蛋白带,抗猪生长激素血清免疫印迹法证明这一蛋白带具有免疫活性,表明猪生长激素cDNA已在枯草杆菌及短小茅抱杆菌中表达。     

牛生长激素cDNA的分子克隆

我们克隆了与牛生长激素Poly(A)⁺RNA互补的DNA(cDNA)。首先从小牛垂体中提纯总的Pply(A)⁺RNA,用AMV逆转录酶合成单链cDNA,以单链cDNA为模板合成双链cDNA,用多聚G及多聚c谱尾法将双链cDNA克隆到pBR322质粒的Pst I位点上,构建成牛垂体PoIy(A)⁺RNA的cDNA文库。以牛生长激素基因为探针,筛选出7个阳性菌落,经电泳鉴定有两个菌落(1号和2号)含有大于500bp的插入片段。1号克隆经酶切图谱、southeTn blot 杂交及序列分析证实含有牛生长激素的编码序列。     

革胡子鲶生长激素cDNA克隆与蛋白质结构分析

从革胡子鲶(Clarias lazera(Burchell))的脑垂体组织中提取总RNA, 应用RT-PCR方法, 扩增得到了革胡子鲶生长激素(Growth hormone, GH)基因cDNA的开放阅读框(Open reading frame, ORF)序列。ORF全长为603 nt, 编码由22个信号肽氨基酸和178个成熟肽氨基酸共同组成的生长激素前体蛋白。序列同源比较结果表明, 研究中得到的革胡子鲶生长激素氨基酸序列与GenBank中已报道的其他6种鲶形目鱼类的氨基酸序列同源性高达95.8%。二级结构预测分析结果表明, 革胡子鲶生长激素蛋白中含有a 螺旋、b 折叠和b 转角以及无规卷曲等二级结构, 以a 螺旋为主, 是典型的a 型结构蛋白质。此外, 抗原性分析表明, 在氨基酸序列中的4个区域均可形成优势抗原表位, 其结构特点非常适合改造成为重组生长激素疫苗或单克隆抗体制剂加以开发利用。     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素(pGH)基因的cDNA进行测序,得到pGH cDNA的全序列,并与Seeburg等报道的序列进行了比较和讨论.然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白XIV启动子的转移载体质粒pSXIVVI+X3/4构建出含pGH基因的重组质粒pX3/4-pGH.将pX3/4-pGH与致死缺失型线性化AcMNPV-OCC- DNA共转染Sf9细胞,构建出既能形成多角体又能表达pGH基因的苜蓿丫纹夜蛾核多角体重组病毒AcMNPV-pX3/4-pGH-OCC+.感染重组毒株的Hi 5细胞可溶蛋白及其培养上清的SDS-PAGE和Western blot的分析结果表明,感染细胞的蛋白电泳带的20.7 kDa处有一条猪生长激素特异带,但培养上清中没有.凝胶黑度扫描估测结果显示pGH蛋白占细胞可溶蛋白的4.48%.     

鲫两种不同生长激素cDNA的分子克隆和分析

从鲫脑垂体组织提取总RNA ,采用 3′RACE PCR的方法 ,从单一垂体总RNA中扩增出编码两种不同类型鲫生长激素的cDNA :生长激素Ⅰ (GrowthhormoneⅠ ,GHⅠ )和生长激素Ⅱ (GrowthhormoneⅡ ,GHⅡ )。将两种类型的鲫GHcDNA分别克隆到pGEM TEasyVector上进行序列测定和分析。克隆的鲫GHⅠ和GHⅡcDNA均包括编码 188个氨基酸残基的GH成熟肽序列和 3′端的非翻译区 ,但不含信号肽序列和 5′端非编码区。序列分析结果表明 ,鲫GHⅠ的碱基序列和推测的氨基酸序列与国外已经发表的金鱼GHⅠ的同源性分别为 98 7%和 97 9% ;GHⅡ的碱基序列和推测的氨基酸序列与金鱼GHⅡ的同源性分别为 99 1%和 99 5% ,虽然同源性较高 ,但仍具有一定的差异     

猪生长激素cDNA的分子克隆

用改进的氯化锂沉淀沉法和寡聚(dT)一纤维素亲和层析法由猪垂体制得总mRNA。以此总mRNA为模板,合成cDNA。钝端连接重组到质粒pUC19的SmaI位点,转化E.coli JM107,筛选出阳性克隆。用限制性内切酶酶切签定及5’端部分核苷酸序列分析证明:克隆了全长猪生长激素cDNA,其长度约为896bp。     

大黄鱼生长激素基因的分离及序列测定

本文从大黄鱼 (Pseucdosiaenacrocea)脑下垂体中提取得到总RNA ,根据近源鱼种生长激素(GH)基因保守序列设计了上游和下游引物 ,通过反转录和PCR扩增得到大黄鱼生长激素cDNA片断 ,并进行序列分析。所得到的序列与近源鱼种生长激素基因序列有较高的同源性 ,断定为大黄鱼生长激素基因序列 ,本序列的测定对进一步研究其生物活性和在工程菌中的表达及应用打下了基础。     

信息交流

10 828条籼稻全长cDNA的分离和注释华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室国家植物基因研究中心谢卡斌、张建伟、向勇等与中国科学院国家基因研究中心冯旗、韩斌等九位专家教授,对此课题作了研究和注释。它们对全长cDNA基因组学和蛋白质组学研究有着非常重要的价值。以分离籼稻基因组全长cDNA为目标,从优良的籼稻恢复系明恢63中分离到10 828条非冗余的全长cDNA,其中780条是新的水稻表达序列,新得到的全长cDNA至少满足以下两个条件之一:(1)5'端序列包含粳稻日本晴的全长cDNA新预测的完整的OKF(9 078条);(2)包含同源蛋白质对应的完整N未端编码序列(6 543条)。在分离到的全长cDNA中,53%的序列比报道的粳稻全长cDNA有更长的5'端非翻译区(5'UTK);90.28%(9 776条)的序列能定位到粳稻基因组序列上,92.7%(10 046条)的序列可以定位到籼稻基因组序列上;     

生长激素和生长激素受体的分子生物学

1 .生长激素的结构生长激素 (ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ ,ＧＨ)一般含有 1 91个氨基酸 ,约 2 2ｋＤ。猪与牛的ＧＨ氨基酸序列具有高度的同源性 (约 90 % ) [1] 。猪和牛的ＧＨ对人没有促进生长的作用 ,可能是猪和牛ＧＨ对人的生长激素受体(ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ ,ＧＨＲ )的结合亲和性低于人ＧＨ对人ＧＨＲ的结合亲和性的缘故。ＧＨｍＲＮＡ翻译的初级产物是前生长激素 ,它比成熟ＧＨ在Ｎ端多出 2 6个氨基酸残基的疏水信号肽[2 ] 。通过Ｘ射线衍射技术等研究发现 ,ＧＨ由 4个螺旋组成 ,自Ｎ端至Ｃ端依次为螺旋 1～ …     

斜带石斑鱼生长激素/催乳素家族基因cDNAs的分子克隆及其进化意义

从斜带石斑鱼垂体提取总。RNA,再取其50ng合成SMART cDNA。从所构建的垂体SMART cDNA质粒文库中筛选到生长激素／催乳素基因家族的2个成员的全长cDNA片段：生长激素(GH)基因全长为938bp,编码204个氨基酸;催乳素基因(PRI．)全长为1429bp,编码212个氨基酸。采用计算机软件Mega 2和CLUSTAL W1．64b对9种鱼的生长激素／催乳素基因家族的3个成员(GH、PRL和生长催乳素SL)的氨基酸序列进行系统分析,构建NJ分支系统树,对于序列中的插入／缺失位点则采用Pairaise Deletion,1000次自展(Bootstrap)分析计算各节点支持率。根据3个基因的氨基酸序列构建的系统树表明,石斑鱼与金头鲷、金鲈和牙鲆聚成一类,虹鳟与大马哈鱼聚成一类,鲫鱼与鲶鱼聚成一类,鳗鲡成另外一类。根据石斑鱼全长cDNA推断的氨基酸序列比较表明,SL相对GH和PRL有较高的保守性。石斑鱼的GH、PRL和SL的氨基酸同源性在24％～31％,但其C-端的氨基酸同源性较高,尤其是C-端的3个Cys是严格保守的。其中SL与GH的同源性(30．8％)高于与PRL的同源性(25．6％),GH和PRL的同源性最低(24．1％)。     

鲤鱼生长激素基因的PCR扩增、克隆及其序列比较

从鲤鱼(Cyprinus carpio)脑垂体中分离其总RNA,经反转录成为第一条链cDNA。以第一条链cDNA为模板,以合成的两段29个寡聚核苷酸为引物,再经过PCR扩增,合成了鲤鱼的生长激素基因,并把其克隆到大肠杆菌表达载体(P^{blue-ocripx Ks+/-})上。序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的鲤鱼生长激素基因的开放读框含有630bp,编码210个氨基酸,其中含有22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟GH序列。我们所克隆的鲤鱼GH基因与Koren发表的鲤鱼GHcDNA的序列在编码区完全一致,但是与chao发表的鲤鱼GHcDNA比较,在编码区核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95．6％和96．7％。     

一种种系发生分析的新方法

利用所测定的猪脂肪组织表达序列标签以及来源于GenBank中非冗余核酸数据库和表达序列标签数据库中的人、牛及小鼠cDNA序列 ,在随机抽样方法建立的基础上 ,分别采集 70个已知功能基因的cDNA序列 ,分析了 4个物种 70× 15 0bp序列连接体的突变规律 ,建立了不同物种之间的综合种系发生分析方法。结果表明 ,在 4个物种 70个已知功能基因所构成的cDNA序列连接体同源性分析中 ,共发现 391个单碱基突变 ,不同物种之间的突变数量大大超过了同一物种基因组水平预测的 1/ 10 0 0。其中以C/T(T/C)转换和A/G(G/A)转换为主要的单碱基突变类型。种系发生分析结果表明 ,作为偶蹄目的猪和牛的遗传关系最近 ,其次是人类 ,小鼠与家猪和牛的遗传关系最远。 4种动物从共同祖先分化的顺序分别为小鼠最早 ,人类次之 ,然后为猪和牛     

达氏鲟生长激素基因cDNA克隆、表达及免疫荧光定位研究

为研究达氏鲟(Acipenser dabryanus)生长激素(Growth Hormone, GH)基因的功能, 合成了达氏鲟垂体SMART cDNA, 克隆得到GH全长cDNA序列。达氏鲟GH全长cDNA序列为1008 bp, 由52 bp的5'端非编码区(Untranslated region, UTR)、编码214个氨基酸的645 bp开放阅读框(Open reading frame, ORF)和311 bp的3'UTR构成。运用GH氨基酸序列构建进化树分析发现, 达氏鲟与两栖类、爬行类和哺乳类的一致性要高于真骨鱼类。实时荧光定量PCR结果表明, 达氏鲟GH mRNA主要在垂体和下丘脑中表达, 且垂体中GH的表达量约为下丘脑的110倍; Western-blot研究结果与qRT-PCR一致, 仅在垂体和下丘脑中检测到生长激素蛋白, 且垂体中GH的表达量远高于下丘脑。免疫荧光定位结果显示, GH主要定位于垂体中部, 下丘脑中也有少量荧光信号; 苏木精-伊红组织切片染色研究表明, GH主要是由嗜酸性的生长激素分泌细胞分泌。研究为深入研究脊椎动物生长激素基因的进化和人工养殖达氏鲟的生长调控提供了基础。       

大黄鱼生长激素基因的分离及序列测定

本文从大黄鱼（Pseucdosiaena crocea)脑下垂体中提取得到总RNA,根据近源鱼种生长激素（GH）基因保守序列设计了上游和下游引物,通过反转录和PC扩增得到大黄鱼生长激素cDNA片断,并进行序列分析。所得到的序列与近源鱼种生长激素基因序列有较高的同源性,断定为大黄鱼生长激素基因序列,本序列的测定对进一步研究其生物活性和工程菌中的表达及应用打下了基础。     

6种重要经济鱼类生长激素完整cDNA的克隆和序列分析

通过RT-PCR、3′RACE、5′-RACE方法,从6种重要经济鱼类——大眼鳜(Siniperca kneri)、石斑鱼(Epinephelus coioides)、黄鳝(Monopterus albus)、鲶鱼(Silurus asotus)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和方正银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch,Fang Zheng crucian carp)中克隆了生长激素(Growth Hormone,GH)的完整cDNA序列(除石斑鱼序列外,其他生长激素序列均系第一次克隆),并详细分析了其序列特征。测序结果显示,克隆的6种GH cDNA长度依次为953bp、1023bp、825bp、1082bp、1154bp和1180bp,它们均包含一个长度为600个左右核苷酸的完整阅读框,分别编码一个200个左右氨基酸的蛋白：大眼鳜、石斑鱼和黄鳝GH为204个氨基酸,鲶鱼GH为200个氨基酸,泥鳅和方正银鲫GH为210个氨基酸。这6种蛋白序列与其他已知的鱼类GH序列都有较高的同源性,特别是与相同目的鱼类序列相比。通过序列比对,在这些蛋白序列内鉴定了许多保守的氨基酸残基,其中的大多数聚集而成5个保守域。基于这6种鱼类序列的编码区和其他鱼类的GH编码序列进行分子系统学分析,结果(MP和NJ树)与根据形态特征构建的系统发育树基本一致,特别是在硬骨鱼类较大分类阶元(目间、目以上)的系统发育研究方面比较一致,尽管仍存在一定差异,说明生长激素基因的编码区应该在硬骨鱼类系统发育研究领域得到更多的重视。     

编码人生长激素的DNA序列在大肠杆菌中的直接表达

编码人生长激素的DNA通过用化学合成的DNA与酶促制备的CDNA连接而建立。这一“杂化物”基因在乳糖操纵子控制下在大肠杆菌中表达,产生的肽在大小和免疫学性质上具有成熟的人的生长激素的特性。 人生长激素(HGH)是垂体前叶合成的具有191个氨基酸的蛋白质。垂体机能减退 的侏儒因HGH缺陷而身材矮小,在儿童期使用人生长激素可以治疗这一缺陷症。另外,HGH在治疗各种创伤疾病如骨折、皮肤烧伤、溃疡等被证实是有效的。由于生长激素具种属专一性,人的尸体成为HGH的唯一来源。 生长激素mRNA的初级翻译产物是一个蛋白前体,含有与生长激素N末端相接的一段信号肽。这种信号或“前”序列是分泌蛋白的特征。对于大鼠生长激素(RGH),已经鉴定了由RGH mRNA制备的CDNA序列中前序列的26个氨基酸残基。由人生长激素cDNA序列获得的信息,我们设计并建立了一个细菌质粒,它可以在微生物细胞中指导合成大量的成熟HGH。