养殖施氏鲟的性腺转录组特征分析

鲟是目前世界上最古老的软骨硬鳞鱼类之一, 雌雄个体之间无明显的第二性征。为了解人工养殖下鲟性腺发育的分子特征, 研究以人工养殖2龄施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt)为研究对象, 对其精巢与卵巢进行转录组测序分析。结果发现, 雌雄性腺中共有19690个差异表达基因转录本, 其中与性别分化相关基因包括转录因子Dmrt1、Sox9、Foxl2等和生长转化因子Amh、Bmp15、Gdf9等。另外, 通过差异表达基因KEGG代谢通路富集分析发现了4条与卵巢发育相关的通路, 分别为黄体酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、卵巢类固醇合成、促性腺激素释放激素信号通路。其中, 卵巢类固醇合成通路中18个差异表达基因的表达模式暗示了2龄施氏鲟限制卵巢雌激素的合成, 但精巢中雄激素的合成未受影响。研究结果为研究鲟性腺分化和发育机制以及今后在mRNA表达水平上鉴定鲟性别提供了基础。     

达氏鲟gpr54基因的克隆及Kisspeptin注射对其表达的影响

G蛋白偶联受体54(GPR54, G protein-coupled receptor 54)是kisspeptin (Kiss)的受体蛋白。Kisspeptin/GPR54系统通过调节促性腺激素释放激素(GnRH)的活性来参与鱼类生殖调控。为了研究Kisspeptin/GPR54系统对达氏鲟(Acipenser dabryanus)GnRH的调控功能, 克隆得到达氏鲟2个gpr54基因的全长cDNA序列, 命名为dsgpr54-1及dsgpr54-2, 分别编码379和368个氨基酸。氨基酸序列比对及进化树分析表明, 达氏鲟Gpr54与四足动物Gpr54序列一致性较高, 亲缘关系较近。荧光定量PCR研究发现, dsgpr54-1的转录本在精巢、卵巢、下丘脑、垂体、中脑及端脑等组织中均有表达, 且在下丘脑中转录水平最高; 而dsgpr54-2仅在脑组织中转录, 且在垂体、中脑及下丘脑中表达丰度均较高。为了研究Gpr54是否可以与其配体Kisspeptin结合调控下丘脑中gnrh基因的表达, 分别合成了达氏鲟Kiss-1和Kiss-2的核心十肽(10 nmol/L、1000 nmol/L), 腹腔注射到9月龄达氏鲟。结果表明, 不同浓度Kiss-1、Kiss-2注射均引起gpr54基因表达量升高, 并且10 nmol/L Kiss-2注射能够显著促进dsgpr54-2的表达(P<0.05)。另外, 不同浓度Kiss-1注射均造成了gnrh转录水平的下降; 而10 nmol/L Kiss-2注射使得gnrh1表达量上升, 而gnrh2的表达量下降, 1000 nmol/L Kiss-2注射则引起gnrh1表达量的下降, gnrh2的表达量没有显著变化。上述研究结果表明, 达氏鲟gpr54基因均能与其配体kiss-1、kiss-2相结合, 但表现出一定的受体-配体选择性差异。Kiss-1、Kiss-2通过激活Gpr54的活性, 调控下丘脑中gnrh基因的表达, 且其调控功能存在差异。     

中华鲟精巢细胞系的建立和鉴定

为了开展中华鲟(Acipenser sinensis)种质资源保存及其精原干细胞体外培养的研究, 采用蛋白酶消化法, 对中华鲟精巢组织细胞进行原代培养, 建立了中华鲟精巢细胞系(Acipenser sinensis testicular cell line, AST), 经352d传代培养, 已稳定传至80代。中华鲟精巢细胞系形态主要呈类纤维状, 培养基为DMEM, 培养温度为25℃, 最适血清浓度为15%。正常传代的AST细胞冻存、复苏后, 经台盼蓝染色, 约(81.36±1.13)%的细胞具有活性, 复苏后细胞仍生长旺盛。染色体核型分析结果显示, 第30代中华鲟精巢细胞系染色体数目分布在142—310, 众数为264。通过RT-PCR检测发现, 在P0和P1细胞中, Sertoli细胞特异表达基因(amh和gsdf)、Leydig细胞特异表达基因(cyp17a1)和生殖细胞特异表达基因(dazl、dnd和vasa)都有表达, 且表达量与精巢中的相似; 在P15、P30和P60细胞中, 只有amh和vasa基因有微弱的表达, 说明细胞系传代到了后期, 只含有极少量的Sertoli细胞和生殖细胞。通过脂质体转染法将pEGFP-N3质粒转入AST细胞中, 可表达增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)。AST细胞系的建立为中华鲟种质资源的保存、精原干细胞的体外增殖与分化、基因功能等研究提供了重要的实验材料。     

基于线粒体DNA控制区序列的重庆岩原鲤人工养殖群体遗传多样性分析

为研究重庆市长寿和涪陵地区岩原鲤(Procypris rabaudi)人工养殖群体的遗传多样性, 采用PCR扩增获得175尾岩原鲤个体的线粒体DNA控制区(mtDNA D-loop)部分序列片段。对其中692 bp序列分析共发现11个单倍型, 其中Hap1为主要单倍型, 占总样本的76.57%。单倍型Hap10演化速率较快, 并且与单倍型Hap6遗传距离最远。长寿及涪陵地区岩原鲤人工群体的单倍型多样性分别为0.4100±0.0550和0.3970±0.0820, 核苷酸多样性分别为0.0013±0.0003和0.0013±0.0004。通过与长江上游江段野生群体(苍溪江段、合江江段、木洞江段、通江江段、万州江段、武隆江段、习水河和唐河)及北碚区人工养殖群体的遗传多样性进行比较, 发现岩原鲤长寿及涪陵地区人工养殖群体遗传多样性明显低于野生群体, 但略高于北碚人工养殖群体。为保持岩原鲤人工养殖群体的遗传多样性, 应尽量选择遗传距离较远的亲本进行配对, 并定期补充不同遗传背景的个体作为后备亲鱼。     

南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝生长及生殖性能的影响

试验旨在研究南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝(Monopterus albus)生长性能、体组成、抗氧化能力、非特异性免疫能力及生殖力的影响。选取二冬龄雌性黄鳝[初始体重(36.41±3.62) g]900尾,随机分为6组(每组3个重复,每个重复50尾),分别饲喂以南极磷虾粉替代饲料中0(对照)、20%、40%、60%、80%和100%的鱼粉制成的6种等氮等能配合饲料,试验周期12周。结果表明:20%磷虾粉替代鱼粉时,雌性黄鳝的增重率(WGR)、特定生长率(SGR)与对照组无显著性差异(P>0.05),但随着替代水平的进一步提高其生长性能显著下降(P<0.05)。20%替代组黄鳝肌肉的粗蛋白质含量显著高于其他组(P<0.05),而粗脂肪、粗灰分各组间无显著差异(P>0.05)。对黄鳝卵巢营养成分进行分析表明,当磷虾粉替代鱼粉比例超过60%时,其粗蛋白、粗脂肪含量均显著下降,水分含量逐渐升高(P<0.05)。进一步对黄鳝肝脏的抗氧化能力进行分析显示,当磷虾粉替代鱼粉比例大于40%时,其超氧化物歧化酶(SOD)活性逐渐下降,而丙二醛(MDA)含量逐渐升高; 100...     

GH重组蛋白对达氏鲟生长、血液生化和体组成的影响

为研究生长激素（GH）重组蛋白对达氏鲟生长、代谢及鱼体肝组分的影响,构建了GH成熟肽融合原核表达载体pET32a-AdGH,并将其在宿主菌BL21（DE3）中诱导表达,重组蛋白rAdGH以包涵体的形式存在。设置了4个试验组,分别在鲟鱼商品饲料中添加含量为0（对照组）、10（低处理组）、50（中处理组）和100 mg/kg（高处理组）的粉状rAdGH,连续投喂8周。结果表明,低水平rAdGH添加能够显著促进鱼体生长,提高特定生长率,降低饵料系数,提高肝体比和脏体比;进一步的分析表明,低水平rAdGH添加可提高除血糖外所有测定的血液指标数值,反映了机体代谢水平的增强。各浓度rAdGH的添加均能提高鱼体肝和肌肉中蛋白质、水分含量,降低脂肪含量。rAdGH对鱼体生长和代谢的影响可能与其剂量相关,低水平的添加可显著增强鱼体代谢水平,加快肝中蛋白质的沉积与脂肪的消耗,促进鱼体生长;高水平的添加进一步增强其代谢水平,但其促生长的功能下降,部分血液指标异常,肝组分异常,疑似肝损伤。研究探索了鲟鱼重组生长激素的生长调控功能,为重组生长激素在鲟鱼养殖中的应用提供了基础。     

中华卵索线虫的研究与应用

中华卵索线虫Ovomermis sinensis Chen etal.作为一种昆虫病原线虫,在农业害虫的生物防治中起着重大作用。文章综述90年代以来我国有关中华卵索线虫的生物学特性、田间应用、体内外培养以及生化与分子生物学研究进展,并对中华卵索线虫今后的研究方向提出建议。     

兴国红鲤ER基因克隆表达及EE2暴露对肝中ER表达的影响

为评估环境内分泌干扰物对鱼类的影响,研究克隆了兴国红鲤雌激素受体（Estrogen receptor,ER）4种亚型ERα、ERβ、ERβ1、ERβ2的全长cDNA序列,氨基酸序列比对发现兴国红鲤ERs分别与3种鲤科鱼类相应亚型具有较高的同源性。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测结果表明,4种ER亚型mRNA在雌雄成体组织中呈现差异表达,雌性个体中,肝、卵巢和肠中4种ERs的表达量均较高;在雄性个体中,ERα和ERβ主要在肝中表达,ERβ1、ERβ2分别在肠和精巢中的表达量最高。将150日龄的兴国红鲤幼鱼分别暴露在0.01、0.1和1 nmol/L的17α-乙炔基雌二醇（EE2）中4周,检测了雌性幼鱼肝中4种ER基因的表达变化情况。在EE2中暴露1-2周后,兴国红鲤雌性幼鱼肝中ERα基因的表达水平有极显著的提升;各浓度EE2能持续显著促进其肝中ERβ的表达;在1-2周内各浓度EE2对ERβ1表达有所抑制;第1周EE2能够抑制ERβ2基因mRNA的表达,并在0.01 nmol/L时抑制作用达到了显著的水平。上述研究结果表明,EE2暴露能诱导或抑制兴国红鲤雌性幼鱼肝中ER亚型的表达,相对于ERβ、ERβ1和ERβ2、ERα可作为EE2短期（1-2周）敏感性生物学标记。     

达氏鲟生长激素基因cDNA克隆、表达及免疫荧光定位研究

为研究达氏鲟(Acipenser dabryanus)生长激素(Growth Hormone, GH)基因的功能, 合成了达氏鲟垂体SMART cDNA, 克隆得到GH全长cDNA序列。达氏鲟GH全长cDNA序列为1008 bp, 由52 bp的5'端非编码区(Untranslated region, UTR)、编码214个氨基酸的645 bp开放阅读框(Open reading frame, ORF)和311 bp的3'UTR构成。运用GH氨基酸序列构建进化树分析发现, 达氏鲟与两栖类、爬行类和哺乳类的一致性要高于真骨鱼类。实时荧光定量PCR结果表明, 达氏鲟GH mRNA主要在垂体和下丘脑中表达, 且垂体中GH的表达量约为下丘脑的110倍; Western-blot研究结果与qRT-PCR一致, 仅在垂体和下丘脑中检测到生长激素蛋白, 且垂体中GH的表达量远高于下丘脑。免疫荧光定位结果显示, GH主要定位于垂体中部, 下丘脑中也有少量荧光信号; 苏木精-伊红组织切片染色研究表明, GH主要是由嗜酸性的生长激素分泌细胞分泌。研究为深入研究脊椎动物生长激素基因的进化和人工养殖达氏鲟的生长调控提供了基础。       

长江鲟org基因的克隆和表达分析

为了研究卵子发生相关基因org基因在长江鲟(Acipenser dabryanus)卵子发生过程的作用, 克隆得到长江鲟org基因(命名为Adorg)的全长cDNA序列, 该序列为1031 bp, 编码233个氨基酸。氨基酸序列比对分析发现, 长江鲟AdOrg与斑马鱼(Danio rerio)ZOrg蛋白序列的一致性最高, 为49.5 %。荧光定量PCR研究发现, 长江鲟Adorg mRNA特异地表达于性腺, 其在卵巢大量表达, 在精巢微量表达, 而在其他组织(肝、肠、脾、肾、心、肌肉、鳃、垂体和下丘脑)均未检测到其表达; 胚胎发育过程的动态表达分析表明, Adorg为母源表达, 在原肠胚之前均具有较高的表达水平, 随后其表达量急剧下降; 进一步研究其在卵子发生的表达模式, 发现Adorg基因在未分化性腺中的表达量极低, 随着卵母细胞的生长发育, 其mRNA表达水平急剧上升, 且维持在非常高的水平, 在Ⅱ期卵巢中的表达量最高。性腺切片RNA原位杂交实验结果表明, Adorg特异地在生殖细胞表达; 在卵巢中, Adorg在卵原细胞的信号较弱, 但在初级卵母细胞中, 其信号急剧增强且分布在卵母细胞的胞质, 且随着初级卵母细胞的生长发育, 其信号也逐渐增强; 在精巢中, 发现Adorg mRNA在A型和B型精原细胞中表达, 而在初级和次级精母细胞中未发现阳性信号。上述结果表明, Adorg基因可能在长江鲟性别分化和卵子发生过程中都起重要作用, 有待通过基因敲降或敲除技术来进一步阐明其功能。