快速纯化重组腺联病毒的受体结合捕捉方法

【目的】建立用于重组腺联病毒(AAV)纯化的受体结合捕捉方法。【方法】将AAV受体的多囊肾病(PKD)结构域1和2与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,利用相变循环(ITC)纯化ELP-PKD融合蛋白;分别用昆虫和AAV-293细胞制备rAAV-GFP,与ELP-PKD融合蛋白共孵育后进行ITC,从沉淀复合物提取病毒DNA进行PCR检测;在优化条件下利用ELP-PKD蛋白结合捕捉rAAV-GFP,利用电子显微镜观察、免疫转印和细胞感染试验进行rAAV鉴定。【结果】ELP-PKD融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC纯化的蛋白纯度大于90%;ELP-PKD蛋白能特异结合rAAV-GFP,结合具有p H、温度和时间依赖性,受体结合捕捉方法可在1h内完成,从两种细胞纯化rAAV-GFP的回收率分别为58%和56%;rAAV-GFP洗脱具有p H和温度依赖性,洗脱rAAV-GFP的回收率分别为46%和44%;纯化rAAV-GFP具有AAV的典型形态和结构蛋白。【结论】建立的ELP-PKD结合捕捉法可用于不同细胞源rAAV的快速纯化。     

快速纯化重组腺联病毒的受体结合捕捉方法（英文）

【目的】建立用于重组腺联病毒(AAV)纯化的受体结合捕捉方法。【方法】将AAV受体的多囊肾病(PKD)结构域1和2与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,利用相变循环(ITC)纯化ELP-PKD融合蛋白;分别用昆虫和AAV-293细胞制备rAAV-GFP,与ELP-PKD融合蛋白共孵育后进行ITC,从沉淀复合物提取病毒DNA进行PCR检测;在优化条件下利用ELP-PKD蛋白结合捕捉rAAV-GFP,利用电子显微镜观察、免疫转印和细胞感染试验进行rAAV鉴定。【结果】ELP-PKD融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC纯化的蛋白纯度大于90%;ELP-PKD蛋白能特异结合rAAV-GFP,结合具有p H、温度和时间依赖性,受体结合捕捉方法可在1h内完成,从两种细胞纯化rAAV-GFP的回收率分别为58%和56%;rAAV-GFP洗脱具有p H和温度依赖性,洗脱rAAV-GFP的回收率分别为46%和44%;纯化rAAV-GFP具有AAV的典型形态和结构蛋白。【结论】建立的ELP-PKD结合捕捉法可用于不同细胞源rAAV的快速纯化。     

水母雪莲查尔酮合酶基因的克隆、表达及酶活分析

从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。用Ni-NTA预装柱对融合蛋白进行亲和纯化,对纯化蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白具有查尔酮合酶活性,可催化底物4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合生成产物柚皮素查尔酮。     

HCV丝氨酸蛋白酶小分子底物构建及GST融合表达

丝氨酸蛋白酶是丙型肝炎病毒重要的功能蛋白和药物作用靶点,其通过分子内（cis）和分子间（trans）方式催化水解前体蛋白,释放病毒功能蛋白。目的：为深入研究病毒蛋白酶活性和抑制剂鉴定需要,实验研究参照丙型肝炎病毒1a亚型菌株蛋白酶天然底物的氨基酸序列特点,设计了一段包含两个天然底物酶切位点的小分子多肽2S,并进行了原核表达。方法：利用PCR方法,合成2S小分子多肽基因,目的基因两端引入BamH I和EcoR I两个限制性酶切位点,双酶切后将基因与表达载体pGEX-4T-2重组,转化大肠杆菌DH5α,经化学诱导进行GST融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化的GST 2S融合蛋白在体外反应系统进行酶切鉴定,SDS-PAGE和ELISA鉴定酶切结果。结果：PCR合成的小分子底物多肽2S基因,经与表达载体重组后测序,证实基因序列正确。采用0.5mmol/L浓度的IPTG诱导工程菌过夜,获得表达的目的蛋白,经分离纯化得到融合蛋白GST-2S。GST-2S在体外磷酸盐缓冲系统中与丝氨酸蛋白酶反应,15%SDS-PAGE鉴定酶切产物,证实融合蛋白底物条带明显消失,ELISA结果同样说明融合蛋白的底物活性。结论：含有两个天然底物酶切位点的小分子多肽可以替代病毒天然底物,实验结果为丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶活性研究和酶抑制剂研究奠定了方法学基础。     

拟南芥阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的原核表达、纯化及酶催化特性

阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(Kds D)是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)生物合成途径的第一个关键限速酶,通过无缝克隆技术将拟南芥Kds D基因构建至原核表达载体p ET-HTT,经过IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了大量重组蛋白的可溶性表达;表达产物经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)方法进行酶蛋白的分离纯化步骤,得到纯度85%以上的高纯度酶;分子筛层析结果发现纯化后的目的蛋白Kds D在溶液中主要以多聚体、二聚体和单体形式存在,这同微生物来源Kds D酶在溶液中以四聚体形式存在很大差异;进一步使用Western blotting和MALDI-TOF MASS技术对纯化的蛋白进行鉴定;测定了拟南芥Kds D酶学性质,证明该酶催化反应的最适p H值为8.0,最适作用温度为37℃,各种金属离子在低浓度均对酶活性存在不同程度的抑制作用,其中以Co~(2+)、Cd~(2+)对酶活性的抑制作用最强,而5 mmol/L金属螯合剂EDTA对酶有激活作用。此外,以阿拉伯糖-5-磷酸(A5P)为底物时,拟南芥Kds D酶动力学常数Vmax和Km值分别为0.18 mmol/(L·min)、0.16 mmol/L,比较发现该酶与底物的亲和性高于大肠杆菌Kds D。以上研究结果为Kds D蛋白结构与功能及其在新型抗生素研制领域中的工业化应用奠定了基础。     

BACE蛋白的表达、纯化和活性测定

在大肠杆菌中表达、纯化并重新折叠以获得有活性的酸性蛋白水解酶 (BACE蛋白 )———一种与阿尔茨海默病 (AD)发病相关的蛋白水解酶。克隆BACE活性区的表达序列到原核表达载体 pET11a中 ,经E .coliBL2 1(DE3)表达 ,从包涵体中获取蛋白质 ,电泳鉴定后经梯度反向快速折叠法重新折叠 ,柱层析分离纯化 ,得到了表达的重组可溶性BACE蛋白 ;用高效液相色谱、质谱等方法检测其对人工合成多肽底物的水解作用 ;测定了BACE蛋白的酶促动力学常数。结果表明 ,得到的重组BACE蛋白具有水解人工合成小肽底物的活性。     

热稳定性丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶异源表达及其在乙酰辅酶A合成中的应用 *

乙酰辅酶A被广泛应用到生物医学研究中,使用TPP代替昂贵的ATP为辅因子合成乙酰辅酶A受到广泛关注.新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)来源的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(TnPFOR)在大肠杆菌中进行了重组表达,分析了其酶学特性,并探讨了利用嗜热酶(TnPFOR)酶法合成乙酰辅酶A.采用pET-20b(+)载体,将新阿波罗栖热袍菌来源的四亚基组成的嗜热酶(TnPFOR)在大肠杆菌中进行异源表达;通过热处理和阴离子交换层析法纯化嗜热酶(TnPFOR);重组表达的嗜热酶(TnPFOR)的最适反应温度和pH分别为90℃和6.5,TnPFOR在90℃下孵育1h时保留了50%活性.利用嗜热酶(TnPFOR),以TPP为辅酶合成了乙酰辅酶A,并探讨了不同温度,丙酮酸钠底物浓度和反应时间对乙酰辅酶A合成的影响.得到的优化条件为:最适反应温度为90℃,丙酮酸钠浓度为1.5mmol/L,反应时间为2min.     

蜘蛛多肽毒素JZTX-51和JZTX-26的重组表达和纯化

为建立一种简便、快速且能大量获得富含二硫键的蜘蛛多肽毒素JZTX-26 (35 aa)和JZTX-51 (27 aa)的有效方法,利用PCR的方法克隆成熟肽编码基因并插入至大肠杆菌Escherichia coli表达载体pMAL-p2x中与MBP(麦芽糖结合蛋白)标签融合,构建重组表达质粒pMAL-jz26和pMAL-jz51。在受体菌TB1和BL21(DE3)中对两个重组表达质粒分别进行IPTG诱导表达,通过Amylose亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE分析;采用因子X对融合蛋白进行酶切后通过分子筛以及反相高效液相色谱对两种重组蛋白进行纯化。通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,表达产物的分子量与预期的多肽理论分子量一致。1L表达培养液中能获得大约5mg纯化的目的蛋白JZTX-26或JZTX-51。结果表明利用该原核表达体系可对蜘蛛毒素基因jztx-26和jztx-51进行融合表达,并对重组蛋白进行亲和层析,为采用基因工程的手段大量获得蜘蛛多肽毒素奠定了基础。     

人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的表达及其结构初步研究

为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究。首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A(1~61)基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A(1~61)融合蛋白。经Ni-NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白。最后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态。结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A(1~61)原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95%以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式。本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础。     

乙酰化修饰调控结核杆菌异柠檬酸裂合酶的研究

目的:探索结核杆菌异柠檬酸裂合酶(ICL)蛋白322位点赖氨酸(Lys322)的乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用。方法:构建结核杆菌ICL蛋白原核表达载体p ET28a-icl,并对Lys322位点进行定点突变为精氨酸(Arg,R)和谷氨酰胺(Glu,Q),体外表达纯化获得重组蛋白ICLWT、ICL322R和ICL322Q。通过Western blotting和酶活性测定来揭示Lys322位点突变前后对蛋白的乙酰化修饰水平及蛋白功能的影响。结果:Western blotting检测发现大肠杆菌表达体系获得的ICLWT、ICL322R和ICL322Q蛋白均有较高水平的蛋白赖氨酸乙酰化修饰信号,较ICLWT,ICL322R和ICL322Q突变蛋白的酶活性分别下降了大约50%和70%。结论:在大肠杆菌的表达体系中,ICL蛋白可以获得乙酰化修饰。ICL322Q突变蛋白酶活性的显著下降,揭示Lys322位点乙酰化修饰对ICL蛋白的功能存在负向调控。为未来深入探索赖氨酸乙酰化修饰对结核杆菌代谢,潜伏感染的调控作用奠定了基础。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.