SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆、表达及活性测定

利用PCR基因扩增法,以SARS冠状病毒全基因质粒为模板,获得N蛋白相应抗原基因,构建了表达载体pBV220／SARS-N,并在E．coli中获得高效表达。用纯化后的N蛋白抗原包被测定板,通过间接ELISA法对阴阳性血清进行活性测定,结果表明,在46份阳性血中有41份被测出,检出率为89．13％。本研究克隆并表达了SARS冠状病毒N蛋白,为进一步研制SARS病人抗体检测试剂和SARS疫苗奠定了基础。     

HCV丝氨酸蛋白酶小分子底物构建及GST融合表达

丝氨酸蛋白酶是丙型肝炎病毒重要的功能蛋白和药物作用靶点,其通过分子内（cis）和分子间（trans）方式催化水解前体蛋白,释放病毒功能蛋白。目的：为深入研究病毒蛋白酶活性和抑制剂鉴定需要,实验研究参照丙型肝炎病毒1a亚型菌株蛋白酶天然底物的氨基酸序列特点,设计了一段包含两个天然底物酶切位点的小分子多肽2S,并进行了原核表达。方法：利用PCR方法,合成2S小分子多肽基因,目的基因两端引入BamH I和EcoR I两个限制性酶切位点,双酶切后将基因与表达载体pGEX-4T-2重组,转化大肠杆菌DH5α,经化学诱导进行GST融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化的GST 2S融合蛋白在体外反应系统进行酶切鉴定,SDS-PAGE和ELISA鉴定酶切结果。结果：PCR合成的小分子底物多肽2S基因,经与表达载体重组后测序,证实基因序列正确。采用0.5mmol/L浓度的IPTG诱导工程菌过夜,获得表达的目的蛋白,经分离纯化得到融合蛋白GST-2S。GST-2S在体外磷酸盐缓冲系统中与丝氨酸蛋白酶反应,15%SDS-PAGE鉴定酶切产物,证实融合蛋白底物条带明显消失,ELISA结果同样说明融合蛋白的底物活性。结论：含有两个天然底物酶切位点的小分子多肽可以替代病毒天然底物,实验结果为丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶活性研究和酶抑制剂研究奠定了方法学基础。     

抗丙型肝炎病毒NS3蛋白不同型单抗制备及应用

目的：制备抗丙型肝炎病毒NS3Ⅰ、Ⅱ型单克隆抗体,用于转HCV全长基因细胞免疫组化定位。方法:克隆表达HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ型抗原,免疫Balb／C小鼠,通过细胞融合筛选分泌HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ的细胞株,制备腹水,纯化IgG。结果：制备出3株抗HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ单克隆抗体,有2株为IgG-1型,1株为IgG-2b型,对转HCV全长基因细胞进行免疫组化染色,胞浆为阳性。结论：制备的抗HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ单抗具有良好的特异性。     

丙型肝炎病毒感染的体外培养细胞的抗原表达

建立丙型肝炎病毒（HCV）体外感染细胞模型,观察其感染细胞的HCV抗原表达,用抗HCV抗体和HCVRNA阳性及阴性血清感染MOLT-4细胞,制备细胞片进行免疫酶染色。结果显示HCV感染MOLT-4细胞4天和阴性对照HCV抗原均为阴性;感染后7天胞浆内可见HCV抗原阳性免疫反应产物;15天阳性细胞达到高峰,43天仍可见少量阳性细胞。结果表明HCV体外感染MOLT-4细胞胞浆内观察到HCV抗原表达。     

人重组IL6／IL2融合蛋白的变性、复性及纯化

经超声破碎,分离已表达CH925包涵体,较系统地研究变性剂浓度、融合蛋白浓度对蛋白折叠的影响.在还原型及氧化型谷胱甘肽复性条件下,成功地将融合蛋白CH925折叠成具有IL6及IL2双活性蛋白,IL6的比活为2.3×10⁸U/mg, IL2比活为2.2×10⁶U/mg.经阴离子交换、凝胶过滤层析,获得一定纯度的CH925,配合反相HPLC.洗脱收集蛋白峰,CH925纯度为98%.     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10L RBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95％以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。     

白细胞介素对大鼠海马培养神经元膜电特性的影响

用细胞内微电极记录方法研究了重组人白细胞介素－１β（ｒｈＩＬ－１β）和重组人白细胞介素－２（ｒｈｉＬ－２）对分散培养的新生大鼠海马神经元膜电性质的影响。采用压力脉冲微量给药技术将白介素施加于所记录的细胞表面。结果发现：１００Ｕ／ｍｌ浓度的ｒｈＩＬ－１β使受作用的海马神经元超极化４．２０±１．８６ｍＶ;１００Ｕ／ｍｌ浓度的ｒｈＩＬ－２使５０％受作用的海马神经元去极化１１．１２±３．７１ｍＶ,并伴有强烈的自发放电反应,而１０００Ｕ／ｍｌ浓度的ｒｈＩＬ－２使１００％受作用的神经元超极化３．２５±０．６３ｍＶ,这些神经元的膜阻抗均无明显变化。本实验结果提示ｒｈＩＬ－１β和ｒｈＩＬ－２可显著影响体外培养海马神经元的膜兴奋性。     

甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达

目的:分析比对甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)、聚合酶B2(PB2)和聚合酶A(PA)抗原的序列,克隆表达保守的和变异的表位抗原区段,为免疫学诊断试剂的研究提供候选抗原。方法:采用BioSun生物学软件比较新近公布的A/H1N1流感病毒和我国猪流感病毒浙江株NA、PB2和PA抗原序列,并预测筛选NA、PB2和PA抗原表位保守区段与变异区段,采用PCR逐步合成法合成NA、PB2和PA表位抗原区段基因序列,并利用原核表达载体pBVIL1进行克隆表达。结果:筛选的保守表位抗原区段和变异表位抗原区段为NA/135～180aa、NA/310～350aa、PB2/1～80aa、PA/41～90aa、PA/231～280aa和PA/341～400aa;获得6条表位抗原区段基因序列,且6条表位抗原区段均获得了高效表达,得到纯化后的抗原。结论:获得了A/H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段,为进一步研制特异的甲型流感病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。     

肾癌特异性抗原G250/MN/CA Ⅸ的克隆及真核表达

目的:克隆人肾细胞癌特异性抗原G250基因,使其能够在真核细胞中表达并锚定修饰于细胞膜上。方法:提取人肾透明细胞癌细胞的总RNA,用RT-PCR扩增出G250基因,插入含有人Igκ链前导信号肽、IgG-Fc和GPI锚定信号肽基因序列的真核表达载体pCI-neo-GPI中;将构建的重组质粒pCI-neo-GPI-G250转染RenCa细胞,利用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光检测G250在细胞中的表达。结果:构建的重组质粒pCI-neo-GPI-G250经测序正确;用各种方法对筛选得到的稳定转染细胞进行检测,均可以发现G250的表达,表达部位为细胞膜。结论:克隆出人肾细胞癌特异性抗原G250基因,且G250在RenCa细胞膜上可以正常表达,为进一步研究肾癌肿瘤疫苗的免疫原性提供了必要的前期准备。     

HCV E2区基因在原核系统中的表达

用提取的重组表达载体pET-E2转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,再进行SDS-PAGE,可得到有一条约34 kDa的表达带,与理论推测的蛋白分子量一致,通过Western-blot鉴定,证明此带即为目的蛋白带.该产物有一个六聚组氨酸尾,主要以包涵体形式存在;计算机扫描分析考马斯亮兰染色后的蛋白胶显示目的蛋白占整个菌体蛋白的36%以上,经Ni-柱纯化的E2蛋白纯度可达95%以上;以纯化的E2蛋白为抗原,用ELISA方法检测了20份抗HCV阴阳性血清,结果表明15份抗HCV阳性血清中检出5份E2抗体阳性血清,而5份抗HCV阴性血清中没有检测到E2抗体.