炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化简

目的：构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到厅sE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果：构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0．1mmol/LIPTG诱导3h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论：实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

白念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因SAP2在大肠杆菌中的表达及产物纯化

目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出可溶性的融合蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。结果经PCR扩增获得正确的SAP 2序列并定向插入原核表达载体pMAL-c2x(+)中。重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14 h后表达出可溶性的融合蛋白,并经纯化、切除标签后得到目的蛋白。结论成功构建了白念珠菌天冬氨酸蛋白酶原核表达质粒pMAL-c2x/SAP2,该质粒在BL21(DE3)中可获得高效融合表达,通过亲和层析纯化及标签切割得到了氨基酸序列同天然蛋白一致的目的蛋白。     

炭疽芽孢杆菌EA1蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组炭疽芽孢杆菌EA1蛋白。方法：用PCR方法从炭疽芽孢杆菌A16R疫苗株染色体中扩增编码EA1蛋白的eag基因序列,经过纯化、酶切后克隆到含有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-2中,构建重组载体pGEX-EA1;将空载体（作为对照）、重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western印迹检测融合蛋白的表达。结果：构建了EA1蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化获得了EA1蛋白;Western印迹表明,此蛋白可与GST标签抗体反应。结论：在原核表达系统中表达并纯化得到EA1融合蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

抗菌肽Cec4a的重组表达和抗菌活性研究*

目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性。方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段。利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白。在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示菌检测表达产物的抗菌活性。结果:成功构建pCold-SUMO-Cec4a原核表达质粒,测序分析其序列与预期结果一致。Cec4a融合蛋白表达量为42.8mg/L,纯化后的Cec4a重组蛋白对鲍曼不动杆菌的MIC为4 μg/mL。结论:通过原核表达,并经Ni-NTA亲和层析纯化,获得了具有抗菌活性的重组蛋白Cec4a,为研究Cec4a的生物活性、抗菌机制及应用奠定了基础。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

重组人ERP57蛋白克隆和原核表达

目的：克隆人ERP57蛋白进行原核表达和纯化。方法：采用巢式RT-PCR从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人ERP57 cDNA,构建ERP57原核表达质粒（pET-28a/ERP57）并转化E.coli的BL21菌株。IPTG诱导蛋白表达,并在变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化。分别用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果：成功获得大小为1518bp的人ERP57基因片段,转化菌诱导性表达61kDa的人ERP57蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功获得纯化的重组人ERP57蛋白,为后续ERP57蛋白功能研究奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化

目的:构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到ftsE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果:构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0.1 mmol/L IPTG诱导3 h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论:实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

多聚组氨酸融合标签在蛋白药物开发中的应用

纯化技术是制约蛋白质药物开发及其产业化的关键技术之一。构建多聚组氨酸标签融合蛋白,采用固定金属离子亲和层析进行纯化,是一种高效的蛋白质纯化策略。介绍多聚组氨酸融合标签在蛋白质药物开发中的应用基础和应用概况,分析多聚组氨酸标签在融合蛋白中的位置对亲和层析纯化的影响,总结常用的多聚组氨酸融合表达方式,并对其融合表达样品的预处理、亲和层析纯化条件及其对目的蛋白药物药用安全性和有效性的影响进行探讨。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

小鼠精胺氧化酶的原核表达与鉴定

目的:原核表达和分离纯化小鼠精胺氧化酶(SMO)。方法:采用RT-PCR法从小鼠胚胎干细胞(ES细胞)RNA中克隆小鼠SMOcDNA,构建SMO原核表达质粒并转染大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,将表达的小鼠SMO重组蛋白在变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化和透析复性。结果:在大肠杆菌中高表达出小鼠SMO重组蛋白;纯化并透析复性后的重组SMO具备快速氧化特异性底物精胺的酶活性。结论:建立了原核表达和纯化有活性小鼠SMO的实验方法。     

拟南芥VSP2蛋白的重组表达及其酸性磷酸酶活性的测定

通过PCR扩增从拟南芥cDNA文库中得到VSP2蛋白的编码序列,将其构建到原核表达载体pET-22b上,并在大肠杆菌BL21菌株中实现高效可溶表达。经过Ni-NTA亲和层析一步纯化,获得电泳纯的重组VSP2蛋白。以pNPP为底物检测,该蛋白具有酸性磷酸酶活性,反应的最适pH值4.5,最适温度为45oC,Km值为26.2mM。重组VSP2蛋白表达量高,纯化后均一性好,适于蛋白晶体生长。     

线粒体自噬受体Bnip3的载体构建及蛋白表达纯化

[目的]获得可用于蛋白晶体筛选的高纯度Bnip3蛋白。[方法]将Bnip3截断基因构建到原核表达载体上并转化大肠杆菌。IPTG诱导表达后通过GST柱纯化目标蛋白。TEV酶切除GST标签后采用凝胶过滤层析纯化Bnip3蛋白。[结果]Bnip3截断基因重组体成功构建并诱导表达目标蛋白。通过GST亲和层析得到可溶性的携带GST标签的Bnip3(1~111)和Bnip3(1~152)蛋白。切除GST标签的Bnip3(1~152)通过凝胶过滤层析得到构象均一的二聚体蛋白。[结论]采用原核表达、亲和层析和凝胶过滤层析可获得构象均一的高纯度二聚体Bnip3蛋白。     

片球菌素pedA基因的原核表达、纯化及生物信息学分析

旨在构建片球菌素PA-1结构基因pedA的原核表达载体,在大肠杆菌体系中实现PA-1的外源表达,运用生物信息学手段分析重组蛋白的理化性质及分子结构。以戊糖片球菌C-2-1的DNA为模板,扩增pedA基因,扩增产物克隆入pET28a(+)原核表达载体,构建pET28a-ped A重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中;30℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达5 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,检测纯化后重组蛋白的抑菌活性;利用生物信息学手段探究重组蛋白的理化性质及分子结构信息。结果显示,pET28a-ped A重组质粒构建成功,带有His标签的PA-1重组片球菌素在大肠杆菌中实现了可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析获得纯化的重组蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的重组蛋白分子量约为7.8 k D,与理论值相符。琼脂扩散法抑菌活性实验抑菌圈效果明显,表明纯化的重组片球菌素具有抑菌活性。生物信息学方法对比分析其蛋白结构发现,获得的重组蛋白含有信号肽,α螺旋占23.53%,疏水性提高,可能促进了重组蛋白的可溶性表达。该实验成功构建了片球菌素PA-1的原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的可溶性表达,该表达可能与其含有信号肽及信号肽疏水性有关,纯化后的重组蛋白抑菌活性明显。     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

LSECtin-CRD-GST融合蛋白的原核表达、纯化及复性

目的:构建C型凝集素LSECtin主要功能结构域CRD的原核表达载体,在大肠杆菌中表达LSECtin-CRD-GST融合蛋白。方法:根据Gen Bank发布的LSECtin基因序列设计引物,利用基因重组技术将获得的LSECtin-CRDc DNA定向克隆至C端带GST蛋白标签序列的融合表达载体p GEX-6p-1中,转化大肠杆菌Origami(DE3)进行重组蛋白的诱导表达,用GST柱亲和纯化融合蛋白。结果:获得了原核表达载体p GEX-6p-1-LSECtin-CRD,诱导表达出大量相对分子质量约40×103的包涵体融合蛋白,经纯化、复性获得可溶蛋白,经Western印迹鉴定为目的蛋白。结论:获得足量的LSECtin-CRD-GST融合蛋白,为进一步研究CRD蛋白结构域的动态构象变化提供了实验材料。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

抗大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体表达与纯化方法优化

[目的]利用大肠杆菌毒素蛋白VTB的五聚体化结构域(VT1B)及梭菌纤维素酶的纤维素结合结构域(CBD),异源表达其与抗大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体(anti-BBI Sc Fv)的融合蛋白,对该单链抗体表达与纯化方法进行优化。[方法]构建CBD-VT1B-anti-BBI Sc Fv融合蛋白大肠杆菌表达系统;应用Ni-NTA树脂与微晶纤维素两步亲和层析法提纯单链抗体融合蛋白。[结果]单链抗体融合蛋白在大肠杆菌中得到大量表达,通过两步纯化法获得了高纯度的融合蛋白,纯度比Ni-NTA树脂一步纯化法提高约12~34%;五聚体融合蛋白与纤维素的结合能力及蛋白纯化效率比单体蛋白提高约1倍。[结论]通过增加纤维素标签和五聚体化结构域,抗大豆胰蛋白酶抑制剂五聚体化单链抗体融合蛋白的纯化效果得到提高。     

一种新型IIa类细菌素的克隆表达和活性鉴定

NB-C1为一种潜在的IIa类细菌素基因,为实现其在大肠杆菌中的高效可溶表达,首先构建了NB-C1蛋白与绿色荧光蛋白 (GFP) 的融合表达载体pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1,然后将构建的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3) pLysS,经诱导表达后,重组蛋白GFP-NB-C1以可溶的形式存在于细胞内。经Ni-NTA亲和层析柱分离纯化后,重组融合蛋白的纯度大于95％,产量达36.1 mg/L。抑菌试验表明,纯化后的重组蛋白对单核细胞增生李斯特氏菌具有明显的抑制作用。