斜卧青霉A10产纤维素酶的酶学性质研究

以斜卧青霉（Penieillium decumbens）A10为出发菌株,经450Gy ^60Coγ-射线诱变处理,选育出一株具有较高纤维素酶活力且传代稳定的正突变株A50,发酵60h后,其CMC酶活和滤纸酶活分别为27．28IU／mL和1．98IU／mL,较出发菌株A10分别提高了33．2％和45．59％。对突变株A50的产酶组分进行研究,通过SDS—PAGE电泳分析,从蛋白质水平上证明突变株A50确实是A10在遗传物质上发生改变的菌株,其CMC酶活最适作用pH值为4．0,最适作用温度为60℃;而滤纸酶活的最适作用pH值为5．2,最适作用温度45℃,二者在一定范围内具有较高的稳定性。     

一株纤维素降解真菌的筛选、鉴定及酶学性质分析

通过对富含枯枝败叶的土壤样品进行富集培养,利用刚果红纤维素培养基初筛和酶活测定复筛得到产纤维素酶的一株真菌,将其命名为GC2-2,并对该菌株进行鉴定及酶学性质研究。结果表明该菌株是一株耐高温、碱性纤维素酶的真菌GC2-2。通过18S rDNA分子克隆测定,该菌为球孢枝孢菌,其滤纸酶的活力优于CMC酶的活力。该菌所产酶的最适反应条件为温度35°C,最适pH值7.5。     

副干酪乳杆菌β-葡糖苷酶的表达、纯化及酶学性质研究

为了实现糖苷类物质的高效转化,将来源于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) TK1501β-葡糖苷酶基因连接于表达载体pET28a(+)上,在E. coli BL21中表达,重组酶经镍离子亲和层析分离得到纯酶,其分子质量和比酶活分别为86. 63kDa和675. 56U/mg。最适作用温度和pH分别为30℃和6. 5。Mg~(2+)和Ca~(2+)对β-葡糖苷酶酶活抑制作用最小,Cu~(2+)几乎使其丧失催化活性。其底物特异性较宽泛,对大豆异黄酮、栀子苷、水杨苷、七叶苷、虎杖苷、熊果苷均有降解作用。以β-pNPG为底物时,该酶的K_m和V_(max)分别为1. 44mmol/L和58. 32mmol/(L·s),催化系数k_(cat)为3 982/s。结果与分析表明,来源于副干酪乳杆菌TK1501β-葡糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷将会发挥重要作用。     

一株高产纤维素酶菌的筛选与鉴定

利用刚果红脱色从森林腐木中筛选到一株高产纤维素酶菌,结合18S rRNA基因序列分析和菌株形态特性分析,确定该菌株为爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum).通过研究粗酶提取时不同离心时间和离心转速对酶活的影响,确定采用3000r/min,15min离心条件下获得的粗酶测定CMC酶活,采用4000r/min,10min的离心条件下获得的粗酶测定FPA酶活和β-葡萄糖苷酶活.酶学性质初步研究显示,纤维素酶反应的最适pH值以5.0为宜;CMC酶最适酶解温度和酶解时间为60℃,15min;FPA和β-葡萄糖苷酶最适酶解温度和酶解时间均为50℃,20min.     

青霉NXP25纤维素酶的产生及性质

青霉（Penicillium sp.）NXP25在5％玉米穗轴粉,3％（麦夫）,0.35％氮源10号和0.3％氯化钙组成的液体培养基（起始pH 5.0）中,10％接种量,29℃,280r/min振荡培养72h。在50℃温度下测定,发酵液内切-1,4-β-葡聚糖酶,外切-1,4-β-葡聚糖酶,β-葡糖苷酶和滤纸酶活力分别为841u/mL,13u/mL,24u/mL和46u/mL。各类型酶最适作用条件分别为pH4.8和60℃、pH5.0和50℃、pH4.     

酸性β-甘露聚糖酶的固体发酵和一般特性

研究了培养基组分和培养条件对黑曲霉WM20-11菌株合成β-甘露聚糖酶的影响。最适培养基和发酵条件为：水12mL,麸皮8g,豆饼粉2g,魔芋粉0.4g,玉米浆0.5mL,(NH4)2SO4 1.0%,CaCl2 0.1%、MgSO4 0.1%,KH2PO4 0.2%(相对于固体料的百分数）,自然pH:31-32℃固体静置培养84h,WM20-11产β-甘露聚糖酶活力达1295U/g干曲。该酶最适作用温度和pH分别为70℃和3.5;在pH2.5-7.0之间稳定,保温30min的半失活温度t1/2为58℃;Ca^2 对酶有激活作用,而Pb^2 、Co^2 、Fe^3 对酶有抑制作用。     

纤维素降解菌Aspergillus sp. YN1的产酶条件及酶学特性

从牛羊粪堆肥中筛选出一株纤维素降解菌Aspergillus sp.YN1,主要研究了液体发酵培养基中碳源、氮源、培养温度、起始pH、通气量以及接种菌龄对菌株YN1的羧甲基纤维素酶活(CMC酶活)及滤纸酶活的影响。研究结果表明,在优化条件下,该菌的CMC酶活、滤纸酶活在培养第3天分别达到0.53U/mL和0.15U/mL。在酶学特性研究中,菌株YN1的CMC酶的最适反应温度为70°C,最适反应pH4.0(酶促反应为30min)。用不同温度处理1h或不同pH处理2h,YN1的CMC酶在30°C?50°C或pH3.0?4.0之间仍可保持80%以上的酶活性,对热及酸表现出较高的稳定性。     

嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)液体发酵产生纤维素酶及酶学性质的研究

探讨了嗜热真菌Chaetomium thermophile产生纤维素酶的液体发酵条件及滤纸酶(FPA)的特性。采用液体发酵培养法,通过对碳源、氮源、培养时间、培养基的起始pH值及产酶过程中pH值和蛋白质含量变化的研究发现：在2％纤维素、1％可溶性淀粉为碳源;2．0％KNO3 0．2％酵母粉为氮源;起始pH值为6．5,50℃下培养9d后,各种酶活最高。发酵过程中,pH值和蛋白质的含量均在前3d下降,后升高。FPA的反应最适温度和pH值分别为60℃和5．5～6．0;且具有较高的热稳定性和DH稳定性。     

产脂肪酶木霉菌株的筛选鉴定及酶学性质研究

筛选到4株可产生脂肪酶的真菌菌株,分别是153—1、13—2、30425和西1-1,经形态观察、ITS序列测方法鉴定,30425、153—1鉴定为Trichoderma harzianum,西1-1、13—2鉴定T.longibrachiatum。研究了脂肪酶的基本酶学性质,153—1、13-2、30425和西1-1酶的最适作用温度为45℃、40℃、20℃、20℃,最适pH为9．5、10．0、7.5、9．5,金属离子对153—1、13—2、30425和西1-1酶活的影响存在差异,其中Mn^2＋、Cu^2、Pb^2＋对4株菌株的酶活均为抑制作用,而Ba^2＋对4株菌株的酶活均为不同程度的激活作用。     

日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶的性质研究

目的:试验确定日本曲霉产β—呋喃果糖苷酶的酶学性质。方法:将β-呋喃果糖苷酶在不同的温度、pH值、底物浓度、反应时间的条件下测定酶活。结果:确定了日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶的性质。日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶分子量约为89kDa,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.5。温度在40℃-60℃,pH在5-7范围内酶比较稳定,最适底物浓度为50%,反应时间3h-4h。结论:确定了日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶的性质,为制取高含量的低聚果糖提供条件。     

地衣芽孢杆菌ws-6产纤维素酶条件优化

目的：通过优化该菌产酶条件,以期在饲料中的进一步应用建立基础。方法：纤维素酶活性用还原糖法测定,产酶条件采用单因素筛选与正交优化方法相结合。结果：培养基初始pH6.5、培养温度37℃、接种量2%2、50 mL三角瓶装液量30 mL、葡萄糖1.5%、羧甲基纤维素钠0.5%、酵母膏1.5%、KH2PO40.05%、NaCl 0.5%,培养48h后酶活性达到最高3.45U/mL;金属离子K＋、Mn2＋、Mg2＋、Zn2＋、Co2＋、Na＋对产酶有激活作用,Cu2＋则抑制酶活性。结论：酶活性比出发菌提高约1.4倍,对饲料制作中提高纤维降解具有一定的实用价值。     

脱枝酶产生菌的分离鉴定及酶学性质研究

目的：从中国高校工业微生物资源与信息中心（CICIM-CU）细菌库中分离具有产脱枝酶酶活的细菌并鉴定,进行酶学性质的研究。方法：通过碘显色平板法筛选产酶菌株,利用16S rDNA确定其属种。对每一株产脱枝酶的细菌进行初步的酶学性质研究。结果：从4005株细菌中筛选出45株产脱枝酶的细菌,建立了产脱枝酶细菌的细菌库。酶学性质表明CICIM B272、CICIMB1-30两株菌产生的脱枝酶,酶反应的最适温度分别为70℃6、0℃,最适pH分别为6.0、5.5,来源于上述两种不同属种的脱枝酶在30-70℃反应条件下,酶在pH 4.5-8.5范围内活性稳定,Li＋、Na＋、K＋、Mg2＋、Mn2＋对两者酶活均有显著的激活作用,而Cu2＋、Fe3＋及EDTA对两者均有显著的抑制作用,Mn2＋、Ca2＋分别对两者的热稳定性具有很好的提升作用。以支链淀粉为底物的动力学常数Km分别为352.883mg/mL、4.5814mg/mL,Vmax分别为30.03mg/min.mL、0.4575mg/min.mL。结论：不同属种的脱枝酶酶学性质差别显著。     

一株耐热脂肪酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从云南省富油地采取了60份土样中,利用透明圈法筛选出一株耐热脂肪酶产生菌。对其酶学性质和发酵条件进行了研究,酶学性质表明,该酶最适作用温度为50℃,最适pH6.0,在pH3.0-8.0范围内稳定,在60℃保温60 min酶活还保留70%;70℃保温60 min残余50%;具有良好的热稳定性;不同金属离子有不同的作用,Ca+,K+对酶有激活作用,Fe3+、Pb2+、Mn2、Cu2+、Al3+、Zn2+对酶活有抑制作用。EDTA对酶影响不大。产酶最佳条件为:MgSO4.7H2O 0.05 g,K2HPO40.1 g,CaCO30.25 g,可溶性淀粉2.5 g,大豆粉2.5 g,装液量50 mL。这株细菌通过培养基优化酶活达到20.3 U/mL。     

乳酸菌Enterococcuse faecalis TN-9低温蛋白酶的提纯及性质

对产自乳酸菌Enterococcuze fecalis TN-9的蛋白酶,进行了硫酸铵沉淀,DEAE—Sephadex A-25以及DEAE Cellulofine A-500离子交换层析的3步纯化和特性研究。纯化酶Native PAGE显示1条蛋白带。SDSPAGE和凝胶层析分子量分别为30ku及69ku。纯化酶最适作用温度为30℃,最适作用PH为7．5～8．0,在pH6．0～9．5和45℃以下条件下稳定,在0℃下显示了6．1％的相对活性,60℃以上热处理完全失去酶活。该酶被EDTA-2Na,Hg^2＋、Cu^2＋、Ni^2＋、Ag^2＋、Co^2＋及Pepstatin A不完全抑制。Zn^2＋对蛋白酶具有明显的激活作用。纯化酶作用于偶氮酪蛋白的Km和Vmax分别为0．098％和72mg／（h·mg）。该酶为N末端VGSEVTLKNS的明胶酶（Gelatinase）的一种,性质属于低温蛋白酶。     

蜗牛酶中一种β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出1种具有人参皂苷Rb_1水解活性的β-葡萄糖苷酶.纯化后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带.反应最适pH为5.6,最适温度是80 ℃.pH稳定范围很广,在pH为4.0～11.0的溶液中和温度60 ℃以下保持长时间稳定状态,是一个耐碱和中等耐热的糖苷酶.Na~+、K~+、Li~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、EDTA、DTT和SDS不影响该酶活性,而Cu~(2+)、Ag~+和Fe~(3+)对该酶则具有明显的抑制作用.pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189 μmol/(min·mg).     

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究

纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%。酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5.0,该酶在pH3.4-6.0下稳定,高温耐受性差。Cu2+、Zn2+、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca2+和Mn2+对酶具有较强的激活作用。     

分支杆菌噬菌体D29 Lysin B的表达、纯化及酶学性质分析

克隆表达噬菌体D29 LysinB(LysB)并对其酶学性质进行研究。以噬菌体D29基因组为模板,用PCR方法扩增lysB基因,与表达载体pET22b连接,将重组质粒转化至Escherichiacoli BL21(DE3)中表达,镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化可溶性表达产物,并对重组蛋白的活性进行分析检测。结果表明:成功构建了pET22b-lysB表达载体,并从1L的LB培养物中获得了33.2mg高纯度重组蛋白(His-LysB);His-LysB具有分解脂肪的能力,属于脂肪酶;生物化学特性分析表明:丁酸对硝基苯(pNPB)为水解底物,His-LysB热稳定性不佳,30℃以下比较稳定,随着温度的升高,稳定性逐渐降低;该蛋白具有较高的pH值适应性,pH5.0~9.5范围内稳定性较高;在23℃和pH7.5时酶活力最高,其比酶活为1.3U/mg;金属离子Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制剂对酶活具有强烈的抑制作用。本研究为开发新的治疗结核药物提供了一个新的选择。     

Purification and characterization of mevalonate kinase from suspension-cultured cells of Catharanthus roseus (L.) G. Don

Mevalonate kinase was purified to homogeneity from Catharanthus roseus (L.) G. Don suspension-cultured cells. The purified enzyme had an M(r) of 104,600 and a subunit size of about 41,500. Kinetic studies indicated an ordered sequential mechanism of action, in which mevalonate was the first substrate to bind and ADP was the last product to leave the enzyme. True values for the kinetic constants were determined for mevalonate, with K(ma) = 76 microM and K(ia) = 74 microM, and for ATP, with K(mb) = 0.13 mM and K(ib) = 0. 13 mM; the true V(max) was calculated to be 138.7 nkat/mg of protein. Product inhibition was only detectable at rather high concentrations: above 0.7 mM for 5-phosphomevalonate and above 2 mM for ADP, with an ADP/ATP ratio of at least 1. Mevalonate kinase activity was shown to be strongly inhibited by farnesyl diphosphate. Farnesyl diphosphate acted as a competitive inhibitor toward ATP, with a K(i) value of 0.1 microM. Mevalonate kinase activity was dependent on the presence of divalent ions. At a concentration of 2 mM, Mg(2+) and Mn(2+) were best and equally effective in sustaining activity; compared to Mg(2+) and Mn(2+), relative activities of 35, 30, 16, 4.8, and 3.4% were detected at equimolar concentrations of Zn(2+), Fe(2+), Co(2+), Ca(2+), and Ni(2+), respectively. The pH-dependent activity profile of mevalonate kinase showed a broad pH optimum between pH 7 and 10, with a maximum at about pH 8.9.     

胶原蛋白酶产生菌的筛选及酶的分离纯化

从堆积骨骼的土样中筛选出高产胶原蛋白酶的MBL13菌株,经鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。对其所产的胶原蛋白酶BCC进行分离纯化,并进行酶学性质的研究。从菌株的发酵液中纯化出分子量约为38.0kDaBCC酶。酶反应的最适温度为40℃,最适pH为8.0。在50℃以下稳定,60℃保温1h酶活仅保留10%;在pH7.0～8.5活性较稳定;金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+对酶有激活作用,金属离子Cu2+对酶有显著的抑制作用。EDTA和EGTA能抑制该酶,表明BCC酶为一种金属蛋白酶。酶的底物特异性表明该酶为骨胶原蛋白酶,且对Ⅰ型骨胶原蛋白水解能力极显著高于Ⅱ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白。将纯化的BCC酶应用于骨胶原蛋白的水解可以得到不同链长的多肽,其水解能力高于标准品胶原酶Ⅰ型。本研究为工业酶提供了新的菌株和新型胶原蛋白酶,为胶原蛋白酶的开发提供了重要的理论依据。     

虎纹捕鸟蛛毒液中透明质酸酶的纯化和部分性质的研究

用分子筛（岛津ＤＩＯＬ－１５０柱）和阳离子交换（岛津ＷＣＸ－１柱）高效液相色谱从虎纹捕鸟蛛（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａｈｕｗｅｎａ）毒液中分离提纯透明质酸酶（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ,ＥＣ３．２．１．３５）．经等电聚焦电泳为一条带,ｐＩ＝７．２．经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为４０ｋＤ,经凝胶过滤测得分子量为４０．７ｋＤ。以透明质酸为底物时在ｐＨ３．５─５．５范围内有较大活性,最适ｐＨ值为４．０;在ｐＨ４．５─６．０范围内稳定,在反应温度为３０─６０℃时有较大活性,最适温度为５０℃;对热稳定,０．１５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ对酶活性有一定的稳定作用．３％的肝素、５００μｍｏｌ／Ｌ的Ｈｇ~（２＋）、Ｆｅ~（２＋）、Ｃｕ~（２＋）对酶活性有明显的抑制作用。