副干酪乳杆菌β-葡糖苷酶的表达、纯化及酶学性质研究 *

为了实现糖苷类物质的高效转化,将来源于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501 β-葡糖苷酶基因连接于表达载体pET28a(+)上,在E. coli BL21中表达,重组酶经镍离子亲和层析分离得到纯酶,其分子质量和比酶活分别为86.63kDa和675.56U/mg。最适作用温度和pH分别为30℃和6.5。 Mg ²⁺和Ca ²⁺对β-葡糖苷酶酶活抑制作用最小,Cu ²⁺几乎使其丧失催化活性。其底物特异性较宽泛,对大豆异黄酮、栀子苷、水杨苷、七叶苷、虎杖苷、熊果苷均有降解作用。以β-pNPG为底物时,该酶的K_m和V_max分别为1.44mmol/L和58.32mmol/(L·s),催化系数k_cat为3 982/s。结果与分析表明,来源于副干酪乳杆菌TK1501 β-葡糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷将会发挥重要作用。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

通过测定黑曲霉β-葡萄糖苷酶的底物特异性,表明该酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。Ag~+、Cu~(2+)和Hg~(2+)对该酶有较强的抑制作用。该酶水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、水杨苷和纤维二糖的Km值分别为2.32、19.11和30.18mmol/L,V_(max)则分别为412、237和198μmol·min~(-1)·mg~(-1),Lineweaver-Burk作图法表明,D-葡萄糖和δ-葡萄糖酸内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为5.17和1.31mmol/L。     

微生物糖苷酶的新型突变酶——硫代糖苷酶的产生及应用

微生物糖苷酶的酸碱功能氨基酸突变酶能催化硫代糖苷的合成,这类酶被称为硫代糖苷酶。目前发展的硫代糖苷酶有β-硫代葡糖苷酶、β-硫代甘露糖苷酶、β-硫代半乳糖苷酶、α-硫代木糖苷酶和α-硫代葡糖苷酶,来源于细菌和古细菌,能合成多种硫代糖苷。最近,硫代糖苷酶被应用于糖蛋白的糖基化修饰,首次人工合成硫代糖蛋白。微生物糖苷酶合成功能的新延伸,对糖生物学、生物技术和制药业的发展将有着重要意义。     

微生物糖苷酶的新型突变酶——硫代糖苷酶的产生及应用

微生物糖苷酶的酸碱功能氨基酸突变酶能催化硫代糖苷的合成,这类酶被称为硫代糖苷酶。目前发展的硫代糖苷酶有β-硫代葡糖苷酶、β-硫代甘露糖苷酶、β-硫代半乳糖苷酶、α-硫代木糖苷酶和α-硫代葡糖苷酶,来源于细菌和古细菌,能合成多种硫代糖苷。最近,硫代糖苷酶被应用于糖蛋白的糖基化修饰,首次人工合成硫代糖蛋白。微生物糖苷酶合成功能的新延伸,对糖生物学、生物技术和制药业的发展将有着重要意义。     

海枣曲霉β-半乳糖苷酶的催化性质

 通过测定海枣曲霉β-半乳糖苷酶的底物特异性,表明该酶水解对-硝基酚基β-半乳糖苷(PNP-β-gal)的活力最高。该酶水解PNP-β-gal,乳糖和对-硝基酚基β-D-岩藻糖苷(PNP-β-fuc)的相对活力为100,63.1,10.3。不同测定方法的结果均表明,这一PNP-β-fuc水解活性来自β-半乳糖苷酶本身。Hg~(2+)、D-半乳糖和D-半乳糖-r-内酯对该酶有强烈的抑制作用,Ag~+和4mol/l脲也有较强的抑制作用。该酶水解PNP-β-gal和乳糖的Km值分别为1.3及36.2mmol/l,Vmax则分别为478和189μmol.min~(-1).mg~(-1)。Lineweaver-Burk作图法及Dixon作图法均表明D-半乳糖和D-半乳糖酸-γ-内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为4和0.9mmol/l。     

贵州传统发酵豆制品中水解银杏黄酮苷的微生物β-葡萄糖苷酶筛选

[目的]微生物β-葡萄糖苷酶法水解银杏黄酮苷具有重要意义,不过目前这方面的研究极少。因此,本文目的是筛选到水解银杏黄酮苷的酶活高的微生物β-葡萄糖苷酶,并分析其底物选择性机制。[方法]以银杏叶提取物作为唯一碳源富集培养,从贵州传统发酵豆豉中筛选产对银杏黄酮苷水解酶活高的β-葡萄糖苷酶的菌株,并对该菌株进行鉴定。然后比较此β-葡萄糖苷酶对不同底物的选择性,同时测定此酶水解银杏黄酮苷反应的米氏常数Km及最大反应速率Vmax。最后,对不同的底物进行分子对接,分析其底物特异性机制。[结果]结果表明,筛选到的菌株GUXN01所产β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷的酶活最高,被鉴定为枯草芽孢杆菌。此β-葡糖糖苷酶对β构型的糖类以及苷类等具有广泛的底物特异性和不同的选择性,尤其对银杏黄酮苷具有很好的亲和性。分子对接研究表明枯草芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶对银杏黄酮苷和其他糖苷类具有不同亲和性和选择性的原因主要是酶结构和底物分子结构的相互作用力的差异导致的。[结论]这些发现为GUXN01所产的β-葡萄糖苷酶应用于水解银杏黄酮苷类生产相应苷元奠定了良好的基础。     

一种快速检测β－半乳糖苷酶活性的试纸方法

建立了一种检测β-半乳糖苷酶活性的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-gal)试纸方法,其原理在于酶色原底物X-gal在β-半乳糖苷酶作用下产生蓝色5-溴-4-氯-吲哚.此方法X-gal用量少、操作简便、省时.适用于基因克隆的检定.     

溜曲霉β-N-乙酰氨基己糖苷酶的催化特性

已纯化的溜曲霉β-N-乙酰氨基己糖苷酶(表现出β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β—N-乙酰氨基半乳糖苷酶活力)水解对硝基酚-N-乙酰氨基葡萄糖苷和对硝基酚-N-乙酰氨基半乳糖苷,其Km值分别为0．44和2．0mol／L。 Vmax值分别为740.0和476．5μmol·min-1·mg-1。氨基葡萄糖、氨基半乳糖、GlcNAc及GalNAc均为这两个酶的竞争性抑制剂,对β-GlcNAca se的KI值分别为34．9、62．5、1 6．9及38．2mmol／L,而对β-GalNAcase的K1值分别为24.1、7 5．0、50．0及1 31．8mmol／L。将pNPGIcNAc和pNPGalNAc等量混合为底物,其酶活力小于单独以pNPGlcNAc为底物的话力,大于以pNPGalNAc为底物的活力。两种底物以不同摩尔分数混合测活结果,用Lineweaver—Burk双倒数法作图,均为直线,求出表观Vmax5 将各个vmax对摩尔分数f(从f=0至f=1)作图,没有出现最大值。由抑制作用及混合底物竞争动力学说明β-GlcNAca se和β-GalNAcase同存在于一个蛋白质,并共用一个活力部位。     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

共表达N-乙酰转移酶提高Aspergillus nidulans α-葡糖苷酶在毕氏酵母中的表达研究

葡糖苷酶以低聚寡糖为底物,通过切割非还原末端α-1,4糖苷键以获得葡萄糖基,同时转苷生成α-1,6糖苷键,广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域。Aspergillus nidulans来源的α-葡糖苷酶在毕氏酵母中外源表达时存在酶活较低、蛋白质降解等问题,为进一步提高α-葡糖苷酶表达量,共表达N-乙酰转移酶(Mpr1)以降低发酵过程细胞受到的氧化胁迫,提高酶活。以实验室保藏的P. pastoris KM71/pPIC9K-AgbB为出发菌株,构建共表达菌株Pichia pastoris KM71/pPIC9K-AgbB/pPICZA-Mpr1,经过摇瓶发酵120h,α-葡糖苷酶转苷酶酶活和蛋白质含量可达22. 56U/ml和0. 52mg/ml,分别是出发菌株摇瓶产酶的1. 92倍和1. 27倍。在此基础上进行3. 6L罐发酵温度和甲醇诱导浓度优化,在25℃,以1%的甲醇浓度诱导发酵最高酶活和蛋白质含量可达128. 12U/ml和1. 81mg/ml,分别是起始菌株上罐产酶的1. 96倍和1. 50倍。     

响应面法优化酶法水解大豆异黄酮糖苷

采用 Design-Expert 软件中 Central Composite Design（CCD）响应面分析方法对β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的4个主要因素（水解温度、水解时间、pH 以及加酶量）进行优化。方差分析发现,影响大豆异黄酮糖苷水解最主要的因素有温度、水解时间和 pH。对各因素进行回归拟合,得到最佳实验条件分别为：温度46．2℃,反应时间94 min,pH 5．1,酶量61单位,此时大豆异黄酮苷元含量达到0．096 g·L－1,比优化前提高了22％。     

应用PMA-qPCR方法快速准确检测发酵乳制品中副干酪乳杆菌活菌的研究

目的 建立快速、准确检测发酵乳制品中副干酪乳杆菌活菌的方法.方法 发酵乳制品中副干酪乳杆菌先经PMA处理后,采用沸水浴的方法提取副干酪乳杆菌基因组,然后通过qPCR方法检测发酵乳制品中的活菌.结果 副干酪乳杆菌经90℃处理6 min,即为膜损伤菌:PMA能够抑制107 CFU/mL死菌DNA的扩增,而不影响活菌DNA的扩增;PMA-qPCR能够准确检测到样品中活菌.结论 建立了一种快速、准确的方法检测发酵乳制品中的副干酪乳杆菌活菌.     

一种改良大便双歧杆菌计数方法

目的：研制一种大便双歧杆菌鉴别计数培养基。方法：利用大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较高的特性,在自制改良BS培养基中加入X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）作为底物,双歧杆菌水解底物释放出吲哚,产生颜色反应。结果：双歧杆菌菌落呈深蓝色。乳酸菌和其它细菌一般为白色或淡蓝色。结论：自制改良BS培养基上双歧杆菌与乳酸菌及其他细菌菌落有明显的鉴别性。适用于大便双歧杆菌鉴别计数。     

新型耐热β-1,4-木糖苷酶的重组表达及酶学性质

【目的】拟对来源于热解纤维素果汁杆菌的新型β-木糖苷酶基因(CoXyl B)进行重组表达和酶学性质研究。【方法】在大肠杆菌系统中成功表达CoXyl B基因,并通过镍柱亲和层析、强阴离子交换和凝胶层析等纯化方法获得纯酶。【结果】对CoXyl B酶学性质的研究结果显示,在以4-对硝基苯酚-β-D-木糖苷为底物时,该酶的最适反应温度为90℃,最适反应pH为6.0。在40–70℃范围内CoXyl B酶活较高且比较稳定。在pH 5.0–6.0之间,70℃孵育1 h后,CoXyl B的相对酶活仍保留80%以上。Ag~+、高浓度的SDS和PMSF对酶活力的抑制作用较显著,而高浓度Mg~(2+)、Li~+和EDTA对酶活力的激活作用较为明显。CoXyl B的k_(cat)和K_m值分别为5.0×10~(–3)s~(–1)和1.9 mmol/L。薄层层析色谱显示CoXyl B具有降解木二糖、木三糖和木四糖的能力。【结论】本研究鉴定出CoXyl B为一种新型的极端耐热木糖苷酶,CoXyl B的酶学性质研究将为其在食品热加工以及生物降解领域中的应用提供参考。     

黑曲霉水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

黑曲霉Aspergillus niger发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液依次经过乙醇沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析,获得了两种电泳纯的β-葡萄糖苷酶BGL1和BGL2,它们的相对分子质量分别为102kDa、97kDa,总酶活回收率达到48%。在pH2.5及温度为55℃时,两种BGL水解京尼平苷的速度均达到最大;BGL水解活性受到Na+的激活但不受K+的影响,但Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+和Hg+等离子对BGL活性有不同程度的抑制作用(其中对BGL1的抑制普遍强于BGL2),而且同一种离子对不同BGL活性的影响性质不同,Ca2+显著激活BGL1而对BGL2无影响,Fe3+显著抑制BGL1而激活BGL2。在同样条件下,BGL对对硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷(pNPGlu)、对硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷(pNPGal)和水杨苷均有催化活性,其中对pNPGlu的Km值最小,BGL1、BGL2分别为0.764和1.934mmol/L;而BGL对京尼平苷水解的催化效率最高,BGL1、BGL2的Kcat/Km值分别为4.28×104和1.04×105L/mol·s。BGL1、BGL2活性的pH稳定范围相近,分别为pH2.0-7.0、pH2.0-8.5,但它们的热稳定性差异较大,55℃时BGL2保温60min,酶活保留了60%,而BGL1的酶活半衰期只有10min。     

固定化重组β-葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮的研究

以壳聚糖微球为载体,采用交联-吸附法固定重组β -葡萄糖苷酶.研究考察了该酶的固定化条件及固定化酶转化大豆异黄酮类底物黄豆黄苷的最适反应体系和系统稳定性.结果显示该固定化酶能够有效转化大豆异黄酮的三种糖苷,黄豆黄苷最适转化条件为pH 6.4,45℃.在pH6.4的缓冲液中4℃贮存25 d后,酶活力仍保持85％以上.固定化重组酶在重复使用10批次的情况下,底物转化率仍能保持在85％左右.     

蜗牛酶中一种β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出1种具有人参皂苷Rb_1水解活性的β-葡萄糖苷酶.纯化后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带.反应最适pH为5.6,最适温度是80 ℃.pH稳定范围很广,在pH为4.0～11.0的溶液中和温度60 ℃以下保持长时间稳定状态,是一个耐碱和中等耐热的糖苷酶.Na~+、K~+、Li~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、EDTA、DTT和SDS不影响该酶活性,而Cu~(2+)、Ag~+和Fe~(3+)对该酶则具有明显的抑制作用.pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189 μmol/(min·mg).     

云南传统发酵豆豉中产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究

目的从云南豆豉样品中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌,并对其产酶条件进行研究。方法从云南省元阳、红河、建水、石屏等地采集豆豉样品,并从中分离得到355株微生物。结果经明胶诱导、脱脂乳平板实验,复筛得到87株蛋白酶产生菌,从中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌。通过X-Gal平板实验,共获得34株产β-半乳糖苷酶菌株,通过酶活测定,最终筛选得到1株高产β-半乳糖苷酶菌株GJ-1-3L,经16S rDNA序列分析鉴定为短乳杆菌;GJ-1-3L在以葡萄糖为碳源、多聚蛋白胨为氮源、起始pH 6.5的MRS培养基中,接种量为4%,35℃发酵培养12 h,其β-半乳糖苷酶活性高达6.73 U/mL,Cu2＋、Ba2＋对酶活有抑制作用,而K2HPO4、MgSO4则能促进酶活。结论 GJ-1-3L菌株来源于豆豉,能够产生β-半乳糖苷酶发酵乳糖,同时产生乳酸,其在食品与乳品加工等方面具有很好的应用前景。     

近暗散白蚁β-葡糖苷酶基因RpBg7的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】白蚁是自然界中利用木质纤维素能力很强的生物,是纤维素酶的天然资源库。本研究旨在挖掘新来源的纤维素酶基因,为生物质能源的高效利用提供新的天然酶。【方法】根据前期蛋白质组测序的结果,利用PCR结合RACE克隆了近暗散白蚁Reticulitermes perilucifugus β-葡糖苷酶7(β-glucosidase 7)基因RpBg7 cDNA全长序列;通过生物信息学软件分析了RpBg7的序列;用表达载体pPICZαA在毕赤酵母Pichia pastoris X-33中表达RpBg7蛋白,并用4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl β-d-glucopyranoside, 4pNPG)为底物检测了表达的RpBg7蛋白的酶活性。【结果】获得了近暗散白蚁的一个内源性β-葡糖苷酶7基因RpBg7(GenBank登录号: MN944395),其开放阅读框长1 485 bp,编码495个氨基酸残基。RpBg7蛋白预测分子量为57 kD,属于糖苷水解酶1(glycosidehydrolase 1, GH1)家族,具有保守的碱性氨基酸残基Glu187和Glu394。通过毕赤酵母表达系统成功表达RpBg7蛋白。酶活性分析结果表明,毕赤酵母胞外分泌蛋白粗酶液和胞内蛋白粗酶液中RpBg7酶活性分别为4.43和7.47 U/mL。【结论】克隆并利用毕赤酵母表达了近暗散白蚁的GH1家族的一个β-葡糖苷酶7基因RpBg7,为后期纤维素酶的改造和应用提供了条件。     

重组根瘤农杆菌葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶性质

目前已发现的葡萄糖耐受型β-葡萄糖苷酶均来源于真菌, 尚无原核细胞来源的相关报道。从根瘤农杆菌LBA4404中克隆β-葡萄糖苷酶基因bg1, 将其构建在表达载体pET-28b上, 转化Escherichia coli RP (DE3), IPTG诱导表达。重组β-葡萄糖苷酶的比活高达36.7 μmol/(min·mg)。对经过Ni柱纯化的重组酶进行酶学分析发现: 该酶是糖基水解酶家族1的成员, 底物亲和力高, 专一性低, 在温度为40°C和pH在5-8之间时具有较高的酶活, 在低于40°C和pH 5-10之间时可稳定保存。以pNP-β-Glc为底物, 该酶的最适pH为6.4, 最适温度为60°C, 在37°C和pH 6.4的反应体系中, 该酶的Km为0.09 mmol/L, 竞争性抑制剂葡萄糖酸-δ-内酯和葡萄糖的Ki分别为0.03 mmol/L和75 mmol/L, 具有很高的葡萄糖耐受性, 当金属离子Ag+和Zn2+存在时, 酶活被明显抑制。该酶对pNP-β-Gal和pNP-α-Glc的Km分别为3.61 mmol/L和14.31 mmol/L。