蝮蛇突触前毒素的结晶及其物化性质的鉴定

江苏和浙江省一带所产的蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒,按前文所描述方法,分离出二个主要神经毒组分。经生理学鉴定其中一个具有选择性地阻断神经肌肉接头突触前传递过程的作用。用等电聚焦板电泳从该组分制备出经聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定为一均一条纹的突触前毒素,定名为蝮蛇神经毒素(agkistrodotoxin),蝮蛇神经毒素对小白鼠(腹腔注射)的最小致死量为每公斤体重55微克,在90℃下保温20分钟毒性不变,用中性连续或碱性不连续SDS圆盘电泳测定的分子量为13,400,不含亚基,用等电聚焦圆盘电泳测得等电点为6.9,在12℃对34%饱和硫酸铵(pH7.0)透析可得长方形晶体。关于蝮蛇神经毒素的其他生理特性,以及蝮蛇毒中其他神经毒素的纯化和鉴定将在另文发表。     

金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒类心脏毒素的纯化及生化分析

金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒经磷酸纤维素P11柱层析分离所得的第8峰(即类心脏毒素),再经磺乙基—葡聚糖凝胶G—25柱层析分离得8A、8B。再将8A、8B分别经葡聚糖凝胶G—50柱层析,得纯化的类心脏毒素A、B。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一的条带。无酶活性。其氨基酸组成及含量基本与Shiau Lin 1975等所测定的结果一致。     

马氏钳蝎的哺乳动物神经毒素的分离和纯化

用CM-Sephadex C-50柱层析法将马氏钳蝎(Buthus martensi Karsch)粗毒分成13个蛋白组分。其中XI峰对哺乳动物(小鼠)、甲壳动物(潮虫科鼠妇属甲壳虫)和昆虫(丽蝇幼虫)都有较强毒性;XII峰对前两类动物有较强毒性;VIII峰对后两类动物有较强毒性。XI峰通过DEAE-Sephadex A-50柱层析被分成XI-1和XI-2两个组分。XI-1峰与XII峰再分别经过Sephadex G-50柱层析被纯化后,经聚丙烯酰胺碱性不连续圆盘电泳和等电聚焦圆盘电泳鉴定均为单一区带。它们都是神经毒素,分别被命名为马氏钳蝎神经毒素I和II。经小鼠腹腔注射,测定粗毒、神经毒素I和II的LD_(50)分别为2.4mg/kg、0.48mg/kg和0.63mg/kg。毒素I有较好的耐热性。工作中还测定了神经毒素I和II的氨基酸组成,它们分别由67和63个氨基酸残基组成,最小分子量分别为7567和7181。     

马氏钳蝎的哺乳动物神经毒素的分离和纯化

用CM-Sephadex C-50柱层析法将马氏钳蝎(Buthus martensi Karsch)粗毒分成13个蛋白组分。其中Ⅺ峰对哺乳动物(小鼠)、甲壳动物(潮虫科鼠妇属甲壳虫)和昆虫(丽蝇幼虫)都有较强毒性;Ⅻ峰对前两类动物有较强毒性;Ⅷ峰对后两类动物有较强毒性。Ⅺ峰通过DEAE-Sephadex A-50柱层析被分成Ⅺ-1和Ⅺ-2两个组分。Ⅺ-1峰与Ⅻ峰再分别经过Sephadex G-50柱层析被纯化后,经聚丙烯酰胺碱性不连续圆盘电泳和等电聚焦圆盘电泳鉴定均为单一区带。它们都是神经毒素,分别被命名为马氏钳蝎神经毒素Ⅰ和Ⅱ。经小鼠腹腔注射,测定粗毒、神经毒素Ⅰ和Ⅱ的LD_(60)分别为2.4mg/kg、0.48 mg/kg和0.63mg/kg。毒素Ⅰ有较好的耐热性。工作中还测定了神经毒素Ⅰ和Ⅱ的氨基酸组成,它们分别由67和63个氨基酸残基组成,最小分子量分别为7567和7181。     

蝮蛇突触前毒素的结晶及其物化性质的鉴定

江苏和浙江省一带所产的蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒,按前文所描述方法,分离出二个主要神经毒组分。经生理学鉴定其中一个具有选择性地阻断神经肌肉接头突触前传递过程的作用。用等电聚焦板电泳从该组分制备出经聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定为一均一条纹的突触前毒素,定名为蝮蛇神经毒素(agkistrodotoxin),蝮蛇神经毒素对小白鼠(腹腔注射)的最小致死量为每公斤体重55微克,在90℃下保温20分钟毒性不变,用中性连续或碱性不连续SDS 圆盘电泳测定的分子量为13,400,不含亚基,用等电聚焦圆盘电泳测得等电点为6.9,在12℃对34%饱和硫酸铵(pH7.0)透析可得长方形晶体。关于蝮蛇神经毒素的其他生理特性,以及蝮蛇毒中其他神经毒素的纯化和鉴定将在另文发表。     

眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒四个神经毒组份的纯化和某些性质的研究

根据前文报导的方法(蔡景霞等人,1980),用羧甲基纤维素葡聚糖凝胶C25分离我国广西眼镜王蛇(Ophiophasus hannah)蛇毒,获得十七个蛋白组份。其中组份7、8、9和11蛋白回收率比较高,且具有明显的抗去极化神经肌肉阻遏作用。 由于它们还含有磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,5'—核苷酸酶和核糖核酸酶等酶活性,我们进一步用羧甲基纤维素CM32和葡聚糖凝胶G50纯化了组份7、8、9和11。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,它们均为单一条带,且具有神经肌肉阻遏作用,没有磷酸单酯酶等酶活性。随后测定了它们的氨基酸组成和N—末端氨基酸。根据离体大白鼠膈神经膈肌标本和去神经大白鼠膈肌标本实验和氨基酸组成测定结果表明,眼镜王蛇毒似乎既含长链神经毒也含短链神经毒,它们的作用部位是在神经肌肉突触后膜,对突触前膜没有影响,都是突触后神经毒素。     

不同产地中华马氏钳蝎神经毒素的分离纯化和部分性质比较研究

经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０,Ｓｐ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５两次柱层析,从没产地的东亚马氏钳歇粗毒中分别得到了一组碱性哺乳动物神经素和一种甲壳类神经毒素,对它们进行的等电点、分子量、动物毒性等部分性质的研究与比较结果表明,淅川、常德与益都产的蝎毒无论在柱层析行为上,还是在等电点、分子量、各组分的毒性大顺序及某些对应组分的结晶行为上有很大相似性,仅存在略微的差异。     

蝮蛇毒的神经毒成分的研究 Ⅲ.蝮蛇毒阻遏神经肌肉传递的作用部位

据报道凡含有神经毒的蛇毒都具有与终板区乙酰胆碱受体结合,从而阻断神经肌肉传递的突触后阻遏作用,其中只有银环蛇毒和澳大利亚虎蛇毒等兼有突触前阻遏作用。本工作对蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒阻遏神经肌肉传递的作用点进行了分析。当小鸡颈二腹肌标本在蝮蛇毒作用下出现传递完全阻遏之后,其肌肉对乙酰胆碱还保持着约50%的敏感性,同时由离子电泳注射法测知,蝮蛇毒能降低大白鼠膈肌终板区的乙酰胆碱敏感性。蝮蛇毒对神经肌肉传递除具有突触后作用外,尚应具有突触前作用。在较低浓度(40～100微克/毫升)蝮蛇毒作用下,小终板电位频率和终板电位的量子含量都有一短暂的增加,然后逐渐下降,但在高浓度下(200微克/毫升),两者在逐渐下降之前均无暂时增加现象。增加溶液中的镁离子浓度或降低钙离子浓度均能使蝮蛇毒引起的神经肌肉完全阻遏的出现时间延长。这些又进一步证实了蝮蛇毒中除含有作用于突触后的成分外,尚含有作用于突触前的成分。从蝮蛇毒中分离神经毒成分的方法已初步建立,根据本工作的启示,再进一步分离突触前毒素的工作已初获成功,有关资料将另行发表。     

蛇毒α—神经毒素及其基因研究进展

蛇毒 α-神经毒素 ( α- neurotoxin,α- NT)是神经毒类毒蛇咬伤中毒主要致死毒素。该毒素作用于突触后运动终板 N型乙酰胆碱受体 ( Ach R) ,α-NT与 Ach R结合后 ,阻止神经肌肉的去极化而引起神经传导阻断 ,导致临床上出现神经肌肉麻痹 ,甚至自主呼吸停止而死亡。然而研究蛇毒α- NT是蛋白质化学、分子毒理学及基因工程等方面课题研究较为理想的材料 ,因为其分子量较小、活性强、理化性质稳定等特点备受广大科学家青睐。作为Ach R受体研究工具 ,特别是近年来发现其具有较多的药理作用后更是加速了其分离纯化以及基因工程生产这一毒素…     

蛇毒磷脂酶A_2对血液系统作用研究的新进展

蛇毒磷脂酶Ａ_２对血液系统作用研究的新进展沈阳军区大连第二疗养院王润鹏,詹明磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）是蛇毒的主要组分之一,是有关凝血和溶血、生物活性等功能的重要工具酶,是突触前神经毒素、肌肉毒素、心脏毒素等活性,具有增强和协同效应的主要酶。近年来有关其?..     

β-银环蛇神经毒素结合蛋白的分离纯化

大鼠膈肌神经突触前膜上存在β－银环蛇毒素结合蛋白。膈肌经匀浆、去垢剂抽提、离子交换层析、植物凝集素亲和层析及银环蛇毒素亲和层析,可获得纯化的β－银环蛇毒素结合蛋白。其比结合活性达１ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白质。整个纯化过程的总得率为３％。纯化蛋白制品的ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示,有两个共纯化的多肽链,其分子量分别为６１和６９ｋＤ。     

川楝素突触前阻遏作用的电生理学分析

利用微电极技术在大鼠膈神经膈肌标本上观察了川楝素对神经肌肉传递的作用,并将所获结果与某些突触前阻遏剂如肉毒和β-银环蛇毒素等的作用进行了比较。(1)在川楝素作用下,间接刺激不能诱起肌肉收缩时,于终板区可记录到终板电位。此时串刺激可诱起一串振幅大小变化无规律的终板电位。(2)川楝素对终板电位和终板电位量子含量的影响是在使之逐渐下降之前有一暂时的升高。(3)小终板电位的发放最终可完全被川楝素所阻断,但在消失前其发放频率长时间维持高于对照,刺激神经使小终板电位发放频率的下降加速。(4)某些神经肌肉传递易化药物如Ca~( )、盐酸胍和4-氨基吡啶也有对抗川楝素的作用,如4-氨基吡啶可明显增大川楝素中毒接头的终板电位的振幅和量子含量,有时甚至恢复肌肉对间接刺激的收缩反应.     

广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中类心脏毒素物理化学性质的研究

前文我们报道了广西产金环蛇蛇毒中类心脏毒素a 及b 的分离。本文就它们的物理化学性质作了进一步研究。二种毒素氨基酸组成十分相似,通过凝胶过滤,测得它们的分子量分别为15,900和12,100。它们N 端的二个氨基酸顺序完全相同,为Gly·Leu…。经羧肽酶A降解测得它们的C 端顺序为……Ala·Cys·Tyr。等电聚焦测得它们的等电点分别为8.8和9.2。紫外吸收光谱显示它们279nmE_(1厘米)~(1%)分别为11.7和12.7。     

增溶抽提β－银环蛇毒素结合蛋白及某些突触前毒素对其结合的抑制作用

β－银环蛇神经毒素阻遏神经肌肉接头递质释放的作用机理，可能与它结合于一种突触前的电压依赖的Ｋ~＋通道有关。本文报告了从大鼠膈肌膜组分中用去垢剂ＴｒｉｔｏｎＸ－１００增溶抽提β－银环蛇毒素结合蛋白的结果。这种结合蛋白抽提液的比结合活性为２００－４００ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白，比膜制备物的比结合活力提高约一倍。抽提得率为５０％－７０％。抽提液与~（１２５）Ｉ标记的β－银环蛇毒素的结合可被曼巴蛇神经毒素（ｄｅｎｄｒｏｔｏｘｉｎ）完全抑制，其ＩＣ_（５０）约８×１０~（－８）ｍｏｌ／Ｌ。但另一种β型神经毒素，β－蝮蛇神经毒素（β－ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｔｏｋｉｎ）却完全不能抑制这种结合。这提示，β－蝮蛇毒素与β－银环蛇毒素具有不同的作用位点。     

广西眼镜蛇蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

目的对广西眼镜蛇毒中磷脂酶A2(PLA2)进行分离纯化,测定其对肝星状细胞HSC-T6的增殖抑制作用。方法采用Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱、Macro-prep High S预装柱结合的方法分离广西眼镜蛇粗毒,经平板法测定各峰的PLA2活性;经SDS-PAGE电泳鉴定终产物纯度并测定分子量,NanoLC-ESI-MS/MS鉴定其组分;CCK-8法测定PLA2对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,确定其凋亡的最小毒性浓度。结果 Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱、Macro-prep High S预装柱层析法,得到第Ⅲ峰具PLA2活性,且达到电泳纯,经NanoLCESI-MS/MS鉴定其为PLA2,分子量约为14.06kD;PLA2在0~1μg/ml的浓度下对HSC-T6细胞具有一定的促增殖作用,2μg/ml时细胞数达到最大值,4~16μg/ml时对细胞生长有抑制作用,且随浓度增大细胞数降低。结论采用Sephadex G-50、CM-Sepharose CL-6B、Macro-prep High S预装柱结合的方法对广西眼镜蛇毒进行分离纯化,得到电泳纯且具PLA2活性的磷脂酶A2;广西眼镜蛇毒PLA2对肝星状细胞HSC-T6增殖有抑制作用,PLA2对HSC-T6细胞的最小毒性浓度为2μg/ml。     

广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中类心脏毒素物理化学性质的研究

前文我们报道了广西产金环蛇蛇毒中类心脏毒素a及b的分离。本文就它们的物理化学性质作了进一步研究。二种毒素氨基酸组成十分相似,通过凝胶过滤,测得它们的分子量分别为15,900和12,100。它们N端的二个氨基酸顺序完全相同,为Gly·Leu…。经羧肽酶A降解测得它们的C端顺序为……Ala·Cys·Tyr。等电聚焦测得它们的等电点分别为8.8和9.2。紫外吸收光谱显示它们279nm E_(1厘米)~(1%)分别为11.7和12.7。     

蝮蛇神经毒素引起的神经肌肉接头超微结构变化

当小鼠接受6—8微克(皮下注射、超最小致死量)的蝮蛇神经毒素后,一般经1—2小时便因呼吸麻痹而死亡。在中毒早期,即出现呼吸困难症状时所取出的样品中,神经肌肉接头超微结构均正常,但在中毒晚期,即呼吸即将停止之前所取出的样品中,接头前部分发生明显变化,主要是突触泡显著减少,甚至完全被排空,线粒体肿胀、破裂、变性和减少。但神经末梢轴突膜平滑匀整,未见Ω型凹陷的形成,突触裂隙和突触后皱褶亦未见变化。这些结果提示,蝮蛇神经毒素也可能和太攀蛇毒素等相似,通过影响突触泡再循环过程,以阻遏神经肌肉间的传递。文中还讨论了蝮蛇神经毒素与其它蛇毒突触前毒素对接头超微结构作用的异同。     

海葵神经毒素研究进展

过去30多年的研究表明,海葵毒液中富含多肽或蛋白类生物毒素活性物质,分子量从3000到80000Da不等。这些毒素可以特异地与某些离子通道或细胞膜受体相结合,从而影响生物的某些生理功能。按照它们功能的不同,可以将海葵毒素大致分为两大类:神经毒素和溶细胞素。由于海葵神经毒素对它们的作用位点具有高度的特异性和亲和性,使得它们成为神经生理学和药理学研究的一种重要工具。就海葵毒素的类型、结构特征、生物活性、应用状况及开发前景的新进展进行综述,以期对同类研究些微启迪。     

尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的研究——Ⅰ.三个毒性组分的纯化

从尖吻蝮(五步蛇)蛇毒中用DEAE-Sephadex A-50,Sephadex G-75,DEAE纤维素和CM-Sephadex C-25柱层析分离纯化,得到三个毒性组分,分别简称为AaT-Ⅰ,AaT-Ⅱ和AaT-Ⅲ。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂免疫电泳鉴定,均表现均一。AaT-Ⅰ和AaT-Ⅱ是酸性蛋白质,等电点分别是4.6及5.3。AaT-Ⅲ是碱性蛋白质,pI>9。它们的分子量均约为22000。     

竹叶青蛇毒血小板聚集剂的分离纯化及生化特性

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤和ＦＰＬＣＭｏｎｏＱ阴离子交换柱层析及Ｓｕｐｅｒｏｓｅ－１２凝胶过滤,从竹叶青蛇的蛇毒中纯化到一个能诱导人血小板聚集的均一组分．经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为６８０００左右．等电点为４．３．测定了它的氨基酸组成,对它活化血小板的作用机理进行了初步研究,结果表明它是一种强的血小板激动剂．