马氏钳蝎的哺乳动物神经毒素的分离和纯化

用CM-Sephadex C-50柱层析法将马氏钳蝎(Buthus martensi Karsch)粗毒分成13个蛋白组分。其中Ⅺ峰对哺乳动物(小鼠)、甲壳动物(潮虫科鼠妇属甲壳虫)和昆虫(丽蝇幼虫)都有较强毒性;Ⅻ峰对前两类动物有较强毒性;Ⅷ峰对后两类动物有较强毒性。Ⅺ峰通过DEAE-Sephadex A-50柱层析被分成Ⅺ-1和Ⅺ-2两个组分。Ⅺ-1峰与Ⅻ峰再分别经过Sephadex G-50柱层析被纯化后,经聚丙烯酰胺碱性不连续圆盘电泳和等电聚焦圆盘电泳鉴定均为单一区带。它们都是神经毒素,分别被命名为马氏钳蝎神经毒素Ⅰ和Ⅱ。经小鼠腹腔注射,测定粗毒、神经毒素Ⅰ和Ⅱ的LD_(60)分别为2.4mg/kg、0.48 mg/kg和0.63mg/kg。毒素Ⅰ有较好的耐热性。工作中还测定了神经毒素Ⅰ和Ⅱ的氨基酸组成,它们分别由67和63个氨基酸残基组成,最小分子量分别为7567和7181。     

马氏蝎毒毒素的分离纯化及其对红细胞膜作用的初步研究

本文用山东产马氏蝎(Buthus martensii kashi)粗毒为材料,经SephadexG-50和Sp-Sephadex C-25二次柱层析,分离纯化获得三个毒峰部分,毒性比粗毒分别提高40—100倍。 纯度鉴定表明三个毒峰的聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳均为一条带,等电点分别为8.7,9.1,9.1,分子量用SDS-不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分别为6,600,5,000和8,500。对纯化蝎毒毒素的氨基酸组分也作了分析。 蝎毒毒素对人红细胞膜作用的初步探索结果表明:它使人红细胞膜的Na.K-ATP酶活性和膜脂流动性有所降低。     

辽宁产东亚钳蝎(Buthus martensii Karshi)毒两种毒素的纯化及其部分性质的研究

用CM-Sephadex C-50分离辽宁产东亚钳蝎毒得到十二个蛋白组份,对其中的第八组份进行了CM-Sephadex C-50重层析和Sephadex G-50凝胶过滤,最后得到两种纯化的毒素。应用低pH系统不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳、SDS-不连续聚丙烯酰胺凝胶板状电泳及等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳鉴定均为单一条带。二者的分子量和等电点分别为8,980,8,660和7.58,7.90。还测定了粗毒对小白鼠的LD50(腹腔注射)、有关酶活力和毒素I的氨基酸组成。 试验结果还表明,用13％胶浓度的SDS-不连续聚丙烯酰胺凝胶板状电泳测定小于10,000道尔顿的蛋白质的分子量,可以获得较为满意的结果。     

蝮蛇突触前毒素的结晶及其物化性质的鉴定

江苏和浙江省一带所产的蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒,按前文所描述方法,分离出二个主要神经毒组分。经生理学鉴定其中一个具有选择性地阻断神经肌肉接头突触前传递过程的作用。用等电聚焦板电泳从该组分制备出经聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定为一均一条纹的突触前毒素,定名为蝮蛇神经毒素(agkistrodotoxin),蝮蛇神经毒素对小白鼠(腹腔注射)的最小致死量为每公斤体重55微克,在90℃下保温20分钟毒性不变,用中性连续或碱性不连续SDS 圆盘电泳测定的分子量为13,400,不含亚基,用等电聚焦圆盘电泳测得等电点为6.9,在12℃对34%饱和硫酸铵(pH7.0)透析可得长方形晶体。关于蝮蛇神经毒素的其他生理特性,以及蝮蛇毒中其他神经毒素的纯化和鉴定将在另文发表。     

蝮蛇突触前毒素的结晶及其物化性质的鉴定

江苏和浙江省一带所产的蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒,按前文所描述方法,分离出二个主要神经毒组分。经生理学鉴定其中一个具有选择性地阻断神经肌肉接头突触前传递过程的作用。用等电聚焦板电泳从该组分制备出经聚丙烯酰胺圆盘电泳鉴定为一均一条纹的突触前毒素,定名为蝮蛇神经毒素(agkistrodotoxin),蝮蛇神经毒素对小白鼠(腹腔注射)的最小致死量为每公斤体重55微克,在90℃下保温20分钟毒性不变,用中性连续或碱性不连续SDS圆盘电泳测定的分子量为13,400,不含亚基,用等电聚焦圆盘电泳测得等电点为6.9,在12℃对34%饱和硫酸铵(pH7.0)透析可得长方形晶体。关于蝮蛇神经毒素的其他生理特性,以及蝮蛇毒中其他神经毒素的纯化和鉴定将在另文发表。     

金环蛇(Bungarus fasciatus Schneider)蛇毒的研究——Ⅰ.金环蛇蛇毒毒性组分的分离纯化与鉴定

金环蛇毒经羧甲基-葡聚糖凝胶C-50柱层析分离为几个主峰,其中Ⅷ、Ⅹ、ⅩⅢ、ⅩⅣ、ⅩⅤ及ⅩⅥ六个峰为主要致死成分。在大白鼠膈神经-膈肌及其他神经肌肉标本上用电生理方法检测蛋白含量较高的Ⅹ_2、ⅩⅢ_2、ⅩⅣ_2及ⅩⅥ_1峰的作用,观察它们对微终板电位、终板电位及肌膜电位的影响。此外,还检测它们的离体去神经肌肉标本对乙酰胆碱敏感性的影响。实验结果提示,ⅩⅣ_2峰及ⅩⅥ_1峰中含有作用于突触后的神经毒性组分,ⅩⅢ_2峰中含有细胞毒性组分,X_2峰中含有细胞毒性及突触前神经毒性作用组分。再经Bio Rex-70柱层析后,从ⅩⅢ_2峰中纯化得一个细胞毒素,从ⅩⅣ_2峰中纯化得一个突触后神经毒素,它们在8M 尿素聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳中呈单一区带。凝胶过滤法测得该细胞毒索的分子量为13200、神经毒素的分子量为7,900。细胞毒素的小白鼠静脉注射最小致死量为4.1微克/克,神经毒素为0.16微克/克。     

不同产地中华马氏钳蝎神经毒素的分离纯化和部分性质比较研究

经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－５０,Ｓｐ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－２５两次柱层析,从没产地的东亚马氏钳歇粗毒中分别得到了一组碱性哺乳动物神经素和一种甲壳类神经毒素,对它们进行的等电点、分子量、动物毒性等部分性质的研究与比较结果表明,淅川、常德与益都产的蝎毒无论在柱层析行为上,还是在等电点、分子量、各组分的毒性大顺序及某些对应组分的结晶行为上有很大相似性,仅存在略微的差异。     

几种新的蝎毒神经毒素的纯化及它们某些性质和结构的初步研究

经Sephadex G-50和Sp-Sephadex C-25两次柱层析,从山东马氏钳蝎(Buthus martensi Karsch)粗毒中分离纯化得到8种哺乳动物神经毒(BmK Ⅰ-Ⅷ)和一种甲壳动物神经毒(CT)。纯度鉴定表明它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳时均呈现一条主带。除BmK Ⅳ外,其等电点在7.9—9.1之间,但BmK Ⅳ呈酸性,其等电点为5.3。SDS-PAGE测得它们的分子量为6000—8000。哺乳动物神经毒的氨基酸组成中Asp的含量较多,而不含Met,CT的氨基酸组成中Gly的含量高于Asp,且含Met,但缺乏Ile和Val。 Bmk Ⅲ和Bmk Ⅳ的N端部分序列比较,发现N端序列具有较强的保守性,15个残基中相同的残基占60％,各组份的CD谱显示它们的主链构象很相似,主要二级结构是β折迭,不含或含较少α-螺旋。     

蝮蛇突触前神经毒素的纯化及其生化性质的进一步研究

本文在前文的基础上,改进了蝮蛇神经毒素的分离方法,纯化了蝮蛇毒中的两个神经毒素之一,突触前神经毒素Agkistrodotoxin(简写为ATX),并对其生化特性进行了分析。应用DEAE-纤维素柱层析、CM-葡聚糖凝胶柱层析和聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳等方法分离纯化,得到一个均一的神经毒素蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶在pH 碱性和pH 酸性电泳鉴定,都呈现一条区带。氨基酸定量分析结果表明,此神经毒素由121个氨基酸组成,由此计算出的分子量为13,700,与用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得值接近。N 末端是门冬酰胺,C 末端是丝氨酸。纯化后的神经毒素显示磷脂酶A 活性,比活相当于粗毒的11倍。     

蝮蛇突触前神经毒素的纯化及其生化性质的进一步研究

本文在前文的基础上,改进了蝮蛇神经毒素的分离方法,纯化了蝮蛇毒中的两个神经毒素之一,突触前神经毒素Agkistrodotoxin(简写为ATX),并对其生化特性进行了分析。应用DEAE-纤维素柱层析、CM-葡聚糖凝胶柱层析和聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳等方法分离纯化,得到一个均一的神经毒素蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶在pH碱性和pH酸性电泳鉴定,都呈现一条区带。氨基酸定量分析结果表明,此神经毒素由121个氨基酸组成,由此计算出的分子量为13,700,与用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得值接近。N末端是门冬酰胺,C末端是丝氨酸。纯化后的神经毒素显示磷脂酶A活性,比活相当于粗毒的11倍。     

外源性蛋白酶对肉毒毒素的作用初探

将B型肉毒毒素在毒素粗提阶段用胰蛋白酶处理,再经浓缩、柱层析和结晶得到纯化的B型肉毒毒素复合物。结果表明:B型肉毒神经毒素经胰蛋白酶处理后单链裂解为双链,在非还原条件下SDS-PAGE显示神经毒素条带,在还原条件下SDS-PAGE只显示轻(L)、重(H)二链条带,而不显示神经毒素条带;纯化后毒素复合物的比活性提高了5.9倍,达到1.60×108LD50/mgPr;HPLC显示活性成分峰面积所占比例增加了9.83%。     

四种不同方法注射眼镜蛇蛇毒对小鼠LD_(50)的影响分析

目的比较小鼠经不同途径注射眼镜蛇蛇毒的半数致死量(LD_(50)),并观察中毒症状。方法将小鼠分别经四种途径注射眼镜蛇毒冻干粉溶液,并根据各组小鼠死亡情况,运用Bliss软件测定LD_(50)估计值、置信区间等。观察各组小鼠生物学行为及死亡情况,并对死亡小鼠和存活小鼠进行解剖分析。结果小鼠经静脉、腹腔、肌肉和皮下注射眼镜蛇蛇毒的LD_(50)分别为0.691 mg/kg、0.741 mg/kg、0.803 mg/kg和0.915 mg/kg,95%CI分别为0.634～0.742 mg/kg、0.676～0.792 mg/kg、0.754～0.856 mg/kg和0.851～1.05 mg/kg。各组小鼠中毒症状明显,表现为呼吸困难、精神萎靡、眼球昏暗、眼角有分泌物、身体出现扭体抽搐等反应,均在2～9 h内死亡。结论小鼠经静脉注射眼镜蛇毒溶液中毒的毒性剂量最小,皮下注射眼镜蛇毒溶液中毒的毒性剂量最大。小鼠经四种不同途径注射眼镜蛇蛇毒的LD_(50)的值按从大到小的排序为皮下注射,肌肉注射,腹腔注射,静脉注射。     

马氏钳蝎毒昆虫类神经毒素的分离、纯化及性质研究

经Sephadex G-50,sp-Sephadex C-25二步柱层析法,从山东马氏钳蝎(Bu-thus martensii Karch)粗毒中分离出四种对美洲(虫非)蠊有强直麻痹反应的毒性蛋白组份。其中二个组分在SDS聚丙烯酰胺电泳和等电聚焦电泳上均呈现单一区带,命名为BmK IT-Ⅰ,BmK IT-Ⅱ其pI分别为8.2和8.4,分子量分别为8400和7560。同时还分析了二个组份的氨基酸组成。经DABITC/PITC双偶合法测定了BmKIT-Ⅰ和BmK IT-Ⅱ的N端部份氨基酸排列顺序,它们分别为H_2NVal.Arg.Asp.Ala……H_2NVal.Arg.Asp.Gly……。 电生理学研究表明,纯化的BmK IT-I(1×10~(-5)g/ml)对(虫非)蠊腹Ⅵ神经节的突触传递有阻断作用,阻断后用生理溶液洗,则突触传递可恢复。从同一蝎毒粗毒中分离纯化的哺乳动物类神经毒素BmKⅢ在浓度高出100倍(1×10~(-3)g/ml)时也可以阻断(虫非)蠊腹Ⅵ神经节的突触传递,但用生理溶液冲洗没有观察到恢复。     

具有中等毒性的马氏钳蝎神经毒素的纯化和初步晶体学…

运用柱层析技术对产自淅川和常德的马氏钳蝎毒素进行分离纯化,得到８种哺乳动物神经毒素。运用制备型等电聚焦电泳技术,对常德样品中具有中等毒性的蝎神经毒素进一步纯化,获得了高纯度样品。两个产地的蝎毒素ＢｍＫ５均已经成功地获得了大晶体。空间群均为Ｐ２１２１２１,晶胞参数分别为：ａ＝３８．４６埃,ｂ＝３７．２８埃,ｃ＝３６．９７埃;ａ＝３８．４４埃,ｂ＝３７．５５埃,ｃ＝３６．８３埃。对两个产地的晶体分别收     

一种东亚钳蝎碱性神经毒素的纯化和初步晶体学研究

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０和ＳＰ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５两次柱层析,从河南淅川马氏钳蝎毒素中分得一种碱性神经毒素ＢｍＫＭＩ８。等电聚聚焦和ＳＤＳ电泳显示单一组分,其ＰＩ为９．１,Ｍｒ为７１００,毒性测试结果表明,该组分对小白鼠有较强的毒性,对昆虫也有一定的毒性。已获得该毒素的两种晶全型的大单晶,并测定其空间群为Ｐ２１２１２１,晶胞参数为：ＢｍＫＭＩ８－Ａ：ａ＝３６．７Ａ,ｂ＝２６．６Ａ,ｃ＝５２     

眼镜蛇蛇毒的分离及各组分毒性测定

应用羧甲基纤维素盐浓度阶段洗脱柱层析法分离湖南眼镜蛇毒获得15个蛋白峰,其中四个神经毒素峰,产率12%.两神经毒主峰合并对小白鼠皮下注射半数致死量为0.13mg/kg,全毒为1.27mg/kg,广西产克痛宁(眼镜蛇神经毒)为0.35mg/kg。本室制备的蛇神经毒活性较全毒提高近9倍。较广西产克痛宁高1.5倍。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果,四个神经毒峰蛋白迁移率分别为0.64,0.70,0.76,0.82。克痛宁为三条神经毒蛋白带,全毒为10条以上蛋白带.     

虎纹捕鸟蛛毒的生物学活性鉴定

本文报道了采集广西产虎纹捕鸟蛛（Selenocosmia huwena)毒液的方法,并对粗毒进行了部分生物学活性的测定,该粗毒对小鼠和蜚蠊的LD50分钟为1．16mg/kg和300ug/g,该粗毒具有透明质酸酶,碱性磷酸酶,蛋白水解酶和脱氧核糖核酸酶活性,未测到磷脂酶A和胆碱脂酶性,通过电生理实验发现该粗毒含有阻断蟾蜍神经肌肉接头传递的毒素,并观察到当小鼠接受腹腔注射致死剂量（5mg/kg)粗毒后便迅速出现呼吸麻痹。     

A型肉毒神经毒素理化及生物学特性研究

目的探究A型肉毒神经毒素的理化及生物学特性,为A型肉毒神经毒素制品的研制提供依据。方法采用SDS-PAGE、HPLC测定A型肉毒神经毒素的纯度;采用毛细管凝胶电泳分析其在非还原条件及还原条件下各组分的相对分子质量;采用等电点聚焦电泳测定其等电点;对其N-末端氨基酸序列进行测序,并将测序结果与NCBI blast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列作比对,确证其各组分的成分;对A型肉毒毒素复合物及A型肉毒神经毒素进行口服毒性分析,并对3批A型肉毒神经毒素原液和其半成品进行生物学稳定性研究。结果 A型肉毒神经毒素纯度99.00%;非还原条件下其相对分子质量约为152 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下,由相对分子质量约为101 000、N-末端氨基酸序列为ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约为101 000、N-末端氨基酸序列为PFVNKQFNYK的轻链组成;等电点为4.91;口服A型肉毒神经毒素的小鼠LD50为1.50×107U/kg,是其复合物的7.9倍;3批A型肉毒神经毒素原液在2~8℃放置28 d生物学活性无下降,平均比活性为2.13×108U/mg,是其复合物的7.1倍;3批半成品在18~26℃放置28 d生物学活性无下降。结论 A型肉毒神经毒素纯度较高,非还原条件下为单链,还原条件下裂解为轻链和重链,其原液及其半成品的生物学稳定性较好。     

具有中等毒性的马氏钳蝎神经毒素的纯化和初步晶体学研究

运用柱层析技术对产自淅川和常德的马氏钳蝎毒素进行分离纯化,得到８种哺乳动物神经毒素。运用制备型等电聚焦电泳技术,对常德样品中具有中等毒性的蝎神经毒素（ＢｍＫ５）进一步纯化,获得了高纯度样品。两个产地的蝎毒素ＢｍＫ５均已经成功地获得了大晶体。空间群均为Ｐ２１２１２１,晶胞参数分别为：ａ＝３８．４６埃,ｂ＝３７．２８埃,ｃ＝３６．９７埃（淅川）;ａ＝３８．４４埃,ｂ＝３７．５５埃,ｃ＝３６．８３埃（常德）。对两个产地的晶体分别收集了２．１埃（淅川）和１．６２埃（常德）分辨率的衍射数据。     

合欢皮总皂苷急性毒理学研究

本文采用常规急性毒理学研究的方法探究合欢皮总皂苷对小鼠的毒性剂量。HE染色观察其主要器官形态学变化,玻璃毛细管法测定血液凝固时间,生化法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)活性。合欢皮总皂苷的最小致毒量为7.5 mg/kg,近似致死量为1500 mg/kg,半数致死量(LD50)为2164 mg/kg。毒性表现为动物活动减少、1500 mg/kg以上剂量使小鼠食欲下降、2250 mg/kg剂量使小鼠体重明显下降;给药后1 d、7 d和14 d给药组血液凝固时间缩短;主要器官形态学明显改变,明显降低主要器官SOD和GSH-PX活性。结果表明合欢皮总皂苷对小鼠有一定的毒性作用。