中国人促红细胞生成素cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

利用PCR技术。以中国人促红细胞生成素(EPO)次全基因组为模板,进行了基因修补和重组．克隆出EPO cDNA全序列。同时发现中国人EPO cDNA与国外的克隆比较有一个核苷酸的差异,导致第62位氨基酸是丝氨酸．不是亮氨酸。将人EPO cDNA基因插入表达载体pSV2-dhfr中的不同克隆位点,构建了6种不同的转移载体质粒,即psV2 dhfr／F1,pSV2／F2,pSV2 dbfT／F3,pSV2 dhfr／F4,pSV2-dhfr／G1和psV2 dhfr／G3。将它们分别转染导人COS-7细胞,结果表明6种转移载体质粒转染的细胞上清液都有明显的EPO活性。人EPO cDNA基因转移载体质粒在COS-7细胞中的表达水平高于人次全EPO基因组转移载体质粒。     

重组人红细胞生成素二聚体不同真核表达载体的构建及表达

为构建重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)二聚体真核表达载体,应用PCR方法扩增EPO cDNA,PCR产物克隆入T载体后,经酶切、连接、转化等过程分别构建了3个EPO二聚体的真核表达载体pBT-1c、pBT-2s及pBT-3c,经测序序列完全正确。然后将3个真核表达载体分别转染于CCS-7细胞及CHO-dhfr-细胞中,用ELISA方法检测,它们在COS-7的瞬时表达量分别为4IU／ml、11.5IU／ml和7.2IU／ml。其中EPO二聚体真核表达载体pBTsv稳定转染CHO-dhfr-细胞后,用氨甲喋呤(MTX)逐渐加压的方法筛选到阳性克隆,表达量可达到4000IU／106cells／72h。     

玉米△12脂肪酸脱氢酶基因（FAD2）在酿酒酵母中的表达

玉米△12脂肪酸脱氢酶是催化油酸形成亚油酸的关键酶。将其编码基因FAD2（GenBank登陆号：DQ496227）克隆到酿酒酵母表达载体pYES2．0中,构建成重组质粒pYE／FAD2,转化到酿酒酵母进行诱导表达,同时以pYES2．0转化子为对照。气相色谱（Gc）分析表明,重组转化子亚油酸的含量占酵母总脂肪酸的1．54％,而对照未检测到亚油酸。表明FAD2基因具有编码△12脂肪酸脱氢酶的功能。为探索转译起始密码子周边序列的改变对FAD2基因表达产生的影响,将该基因的起始密码子上游序列进行修改,构建重组表达载体pYE／FAD2—1,转化酿酒酵母进行表达。GC分析表明,pYE／FAD2—1转化子的亚油酸含量占总脂肪酸含量的8．81％,是对照pYE／FAD2转化子的近5倍。     

SV40载体在COS7细胞中的复制及外源基因的表达

为评价SV4 0载体 COS7稳定表达系统的可能应用价值 ,将含人组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)编码区的SV4 0载体pctPA转染COS7细胞 ,并以G4 18选择培养 2 8d ,得到稳定的抗性细胞库 .Southern印迹和溶圈法分别分析该细胞库在随后的细胞传代中细胞内附加体拷贝数及t PA表达水平的变化 .在经选择培养 2 8d的COS7细胞库中 ,质粒pctPA以染色体外附加体的形式存在 (30 0拷贝 细胞 ) ,t PA的表达水平为 1 1μg d(10 6细胞 ) .在随后 3个月的动态观察中 ,随着细胞传代 ,该COS7细胞库tPA的表达水平虽逐渐递减 ,但在第 1个月内可保持在 1μg d(10 6细胞 )以上 .基于SV4 0载体 COS7稳定表达系统无需筛选克隆 ,在稳定的抗性细胞库形成后的 1个月内可能保持目的基因的高水平表达 ,因而较适合于需同时制备多种重组蛋白的实验 .     

LRP16对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

用Northern印迹方法检测雌二醇 (17β E2 )对LRP16mRNA表达的时间及剂量依赖性调控作用 .构建LRP16基因启动子序列调控的萤光素酶报告子 (pS0 ) ,并与雌激素受体α和 β(ERα和ERβ)表达载体共转染COS 7和MCF 7细胞后测定萤光素酶活性 .将LRP16基因的表达载体转染MCF 7细胞 ,测定过表达LRP16对细胞的生长特性的影响 .17β E2 使MCF 7细胞中LRP16mRNA表达水平增加 ,增加幅度未显示出 17β E2 培养时间和剂量的依赖性 .pS0 与ERα表达载体共转染细胞的相对萤光素酶活性较非共转染组 (对照组 )及pS0 ERβ表载体共转染组升高 5～ 10倍 .LRP16基因过表达促进MCF 7细胞的增殖 .研究表明 ,雌激素可能通过ERα上调乳腺癌MCF 7细胞LRP16基因的表达并促进细胞增殖     

转译优化对EPO基因在COS7细胞中表达的影响

利用ＣＯＳ７细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达的影响。通过ＤＮＡ重组技术,构建了原ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达载体ｐＣＳＶ－ＥＰＯ（１）,其转译起始序列为５＇ＡＡＴＴＣＡＴＧＧ３＇。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成５＇ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ３＇,而构建了另一表达载体ＰＣＳＶ－ＥＰＯ（２）。后经序列分析证明无误后和前均通过ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞上清,测定结果为     

人AADC基因在cos-7细胞中的表达和活性检测

目的　研究人芳香族左旋氨基酸脱羧酶 (AADC)基因在多巴胺代谢过程中的作用。方法　从人胎儿黑质组织中提取总RNA ,以RT PCR法扩增AADCcDNA片段 ,克隆于 pGEM T载体中。测序正确后再构建真核表达载体 ,转染猴肾成纤维细胞COS 7,原位杂交检测AADC表达 ,加入L DOPA后 ,用高效液湘色谱测定转AADC细胞的多巴胺(DA)生成量 ,以了解转基因细胞AADC基因的功能活性。结果　RT PCR扩增出 144 2bp的cDNA片段与Genbank[NM 0 0 0 790 ]登录的序列相同 ,构建真核表达载体 pBK RSV AADC ,原位杂交证实其在COS 7表达阳性率为 70 % - 80 % ,在AADC活性作用下实验组的DA生成量是对照组的 4倍以上 (P <0 0 1)。结论　所克隆的AADC基因可在真核细胞中表达并具有生物活性。可望用于帕金森病的基因治疗。     

人隔蛋白7的真核表达载体的构建及表达

目的构建人隔蛋白7（SEPT7,hCDC10／SEPT7）的表达载体并对U251人脑恶性胶质瘤细胞系进行转染且检测其表达。方法RT—PCR方法扩增SEPT7eDNA片段,并将扩增的片段插入pCDNA3真核表达载体,构建成含SEVT7 eDNA的重组载体pCDNA3／SEPT7,以脂质体介导该质粒转染人脑恶性胶质瘤细胞系U251,应用RT—PCR和免疫荧光染色鉴定转染细胞中hCDC10／SEPT7的表达。用流式细胞术对转染前后的U251细胞进行细胞周期分析。结果成功构建含SEVT7 eDNA的重组载体pCDNA3／SEFT7,并使其稳定转染U251细胞,在转染的细胞中,证实有SEPT7mRNA表达上调。细胞周期检测结果G0／G1。期细胞增多,SPF降低。结论成功构建SEPT7表达载体,并在人脑恶性胶质瘤细胞系获得表达,延迟细胞周期进展。     

中国人促红细胞生成素cDNA的克隆及其在COS—7细胞中的表达

利用PCR技术,以中国人促红细胞生成素(EPO)次全基因组为模板,进行了基因修补和重组,克隆出EPO cDNA全序列。同时发现中国人EPO cDNA与国外的克隆比较有一个核苷酸的差异,导致第62位氨基酸是丝氨酸,不是亮氨酸。将人EPO cDNA基因插入表达载体pSV2-dhfr中的不同克隆位点,构建了6种不同的转移载体质粒,即pSV2-dhfr/F1,pSV2/N2,pSV2-dhfr/F3,pSV2-dhfr/P4,pSV2-dhfr/G1和pSV2-dhfr/G3。将它们分别转染导入COS-7细胞,结果表明6种转移载体质粒转染的细胞上清液都有明显的EPO活性。人EPO cDNA基因转移载体质粒在COS-7细胞中的表达水平高于人次全EPO基因组转移载体质粒。     

沉默MDR1基因增强急性早幼粒白血病耐药细胞HT9药物敏感性

该研究利用短发卡RNA（small hairpinin RNA,shRNA）表达载体沉默HT9急性早幼粒白血病耐药细胞MDRl基因表达,以提高细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。通过设计合成编码shRNA的DNA模板序列,定向克隆到pSilencer2．1－u6neo质粒,成功构建1个P－gP蛋白基因特异的shRNA表达载体,稳定电转染HT9细胞,实时荧光定量PCR分析MDRlmRYAg表达,Westem blot检测细胞P—gp蛋白表达,流式细胞术检测P—gP蛋白外排泵功能,MTT法检测细胞对药物敏感性。结果显示,成功构建了shRNA表达载体pSilencer2-1-U6neo—MDRl,转染HT9细胞后,PCR检测重组质粒整合到HT9／sh－2－1－1细胞基因组DNA,获得稳定遗传;HT9／sh－2－1—1细胞MDRlmRNA表达降低了78．84％（P〈0．01）,P—gP蛋白表达降低了48．27％（P〈0．05）,细胞内Rh0123相对荧光强度由（10．8±0．58）％升高至（73．56±1．37m;转染细胞对三尖杉酯碱、阿霉素敏感性明显增强,IC50分别由（2．06±0．15）gmol／L降至（0．57±0．01）gmol／L、（4．04±017）gmol／L降至（1．56±0．05）μtmol／L。提示shRNA干扰表达载体pSilencer2．1－U6neo—MDRl能够稳定、持久地抑制MDRI基因表达,并能有效增强HT9细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。     

转译起始密码子周边序列的改变对△^6-脂肪酸脱氢酶基因表达的影响

将少根根霉中△^6-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)的起始密码子周边序列作适当的修改,并把修改后获得的片段(RAD6-1)亚克隆到表达载体pYES2．0,构建重组表达载体pYRAD6-1。经测序验证,把pYRAD6-1转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达分析,同时以空载体pYES2．0和出发序列所构建的pYRAD6作为对照。通过气相色谱(GC)和气相色谱,质谱(GC-MS)分析表明,在pYRAD6和pYRAD6-1转化的酿酒酵母中生成γ-亚麻酸,而pYES2．0中没有检测到。其中,pYRAD6-1转化的酿酒酵母γ-亚麻酸表达量占细胞总脂肪酸含量的5．23％,而对照pYRAD6转化的酿酒酵母中表达量只占2．64％。     

SA11株轮状病毒VP7基因的克隆及表达

采用RT PCR方法 ,从提取的SA1 1株轮状病毒总RNA中扩增出VP7基因片段 ,进行鉴定后 ,将该片段克隆于真核表达载体pEF1 HisC dhfr,构建成重组质粒pEF1 HisC dhfr VP7,然后用质脂体法转染COS 7细胞 ,进行真核系统的表达 .获得了长 981bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知VP7序列相同 .表达后经细胞超声破碎 ,Westernblot检测表达产物 ,在相对分子质量 38× 1 0 3 处有表达条带 ,表达蛋白主要存在于上清中 .因此 ,获得了VP7基因 ,并在COS 7细胞中获得了表达 ,表达蛋白质免疫Balb c小鼠 ,获得了具有特异性结合活性的抗体     

CD真核表达载C 体的构建及在 2KHE39 细胞中的表达

目的：构建含自杀基因胞嘧啶脱氨酶（CD）的真核表达载体pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z—CD,并进行哺乳动物细胞HEK293转染研究。方法：以本实验室保存的含CD基因全长的质粒为模版,用PcR方法扩增CD基因阅读框序列,并定向克隆到带有HAtag的pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z载体上,使目的基因与HAtag在同一阅读框。重组体质粒经EcoRI和BamHI双酶切鉴定,并对插入的CD基因片段进行测序,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z—CD用脂质体介导转染HEK293,提取细胞蛋白,western blot检测CD基因的表达情况.结果：阳性重组质粒pcDNA3．1／HA—myc-His（-）ZCD经Eco砌和BanHI双酶切后,获得约为5．5kb片段和1．3kb插入片段,序列分析表明插入的片段与GenBank发布的序列一致．western blot检测到CD基因的表达。结论：成功构建了含自杀基因CD的真核表达质粒。     

鼠OAZ1基因的真核表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

构建鼠OAZ1基因真核表达质粒,观察OAZ1-GFP融合蛋白在绿猴肾细胞COS7中的表达。利用RT-PCR的方法获得鼠OAZ1基因,再利用重叠延伸PCR缺失掉OAZ1序列中的205位碱基T,由此获得无需阅读框移码即可编码全长OAZ1的突变基因。将此突变基因克隆入真核表达载体pEGFP-N1获得重组质粒pEGFP-N1-OAZ1-T。将此质粒瞬时转染COS7后,采用RT-PCR,Western blotting,免疫荧光技术观察检测目的基因的表达情况。结果显示,酶切和测序证明质粒pEG-FP-N1-OAZ1-T构建正确,转染COS7细胞后,OAZ1-GFP融合蛋白能在细胞中高效表达。成功构建了pEGFP-N1-OAZ1-T真核表达质粒,在COS7细胞内,该质粒能成功指导OAZ1-GFP融合蛋白合成。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的重组鼠白血病病毒的特性

通过反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增了H5N1亚型鹅源禽流感病毒 (AIV)完整的血凝素 (HA)基因并进行了克隆与鉴定。序列测定结果已经登陆GenBank ,登陆号为AY6 394 0 5。序列分析表明所扩增的HA基因开放性阅读框架 (ORF)由170 7个核苷酸组成 ,共编码 5 6 8个氨基酸 ,裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF ,含连续的碱性氨基酸 ,具有高致病性AIVHA基因裂解位点的特征。构建了含HA基因的真核表达载体pcDNA HA ,通过与鼠白血病病毒 (MuLV)假病毒构建体系的两种质粒pHIT6 0和pHIT111共转染人胚肾细胞 2 93T ,4 8h后收集假病毒上清 ,超离后通过Western blot证明HA蛋白能够在假病毒颗粒表面表达 ,表明HA能够整合到此病毒粒子表面。通过感染 2 93T、COS 7和NIH3T3三种不同的靶细胞 ,证实所构建的假病毒粒子具有感染性和泛嗜性。本研究成功构建了具有感染性的MuLV HA假病毒体系 ,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

用反式互补表达载体实现全抗体在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：通过弱化筛选基因二氢叶酸还原酶基因（dhfr）,构建双顺反子全抗体表达载体,实现全抗体在CHO细胞中的高效表达。方法：将dhfr基因分为分别编码1-105和106～187氨基酸残基的2部分,分别通过linker与亮氨酸拉链GCN4融合,分别通过内部起始位点序列与抗体轻重链基因偶联,构建成2个双顺反子表达载体pIRESLZdhfr—H和pIRESLZdhfrL。用脂质体2000转染CHO-dhfr-细胞,用无次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的IMDM筛选培养基筛选阳性克隆。结果：筛选到的阳性克隆表达水平为1．47-3．5μg／（106细胞·d）,经氨甲蝶呤（MTX）梯度加压,在MTX浓度为5×10^-8mol／L时,表达水平达到11．5μg／（10^6细胞·d）。结论：构建了基于亮氨酸拉链二聚化基础的dhfr弱化方式的双顺反子表达载体,实现了全抗体在CHO—dhfr-细胞中的高效表达。     

pEGFP-植酸酶基因质粒重组构建及其在COS7细胞中表达分析

采用PCR技术扩增细菌酸性植酸aPPA2基因ORF序列,其DNA分子为1 299 bp,编码432氨基酸,蛋白质分子量约为48 kD a。此植酸酶基因被克隆到pEGFP-N3表达载体的BamH1和Pst1克隆区域,重组的pEG-FP-aPPA2重组质粒经转化到哺乳类培养细胞COS7中。重组的pEGFP-N3-aPPA2在COS7细胞中正常表达并检测出高的植酸酶活性。本研究提出的pEGFP-N3-aPPA2重组质粒构建和在哺乳类COS7细胞表达体系为植酸酶生产提供了新的技术线路。     

含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建

目的构建含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,观察其在293T细胞中的表达。方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶（Furin）／口蹄疫病毒2A多肽（F/2A）连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链,形成一个开放阅读框（ORF）,插入慢病毒表达载体pWPI,构建重组抗P185神睨全长人鼠嵌合抗体表达载体pWPI／H-F2A—L。以已构建的慢病毒表达载体pWPI／H-IRES-L为对照质粒。应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体3质粒系统共转染入293T细胞进行包装,测定病毒滴度。再感染293T细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达和转染效率,RT—PER、ELISA方法分别检测嵌合抗体mRNA和蛋白的表达。结果经测序鉴定,pWPI／H—F2A—L与预期设计一致;pWPI／H—F2A—L组的病毒滴度为4．3×10^5TU／ml,而pWPI／H—IRES—L组的病毒滴度为3．5×10^5TU／ml;两组重组慢病毒的转染效率分别为87．68％和79．08％;两组重组慢病毒感染293T细胞后,都有嵌合重链和嵌合轻链的表达,由F／2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体。结论成功构建了含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,为今后抗P185^erbB2工程抗体的研究奠定了基础。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-7基因的克隆和表达

IGFBP-7是胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)家族中的一员,具有一些抑癌基因的特征。利用重组PCR技术获得了IGFBP-7基因的全长编码区序列,并将其克隆到pcDNA3．1／His—Myc真核表达载体中,得到重组质粒pcDNA3．1／His—Myc—IGFBP-7。将该重组质粒瞬时转染人胚胎肾293T细胞,Westem-blot分析表明,IGFBP-7在293T细胞中获得了表达,为进一步研究IGFBP-7的功能奠定了基础。     

BALB/c小鼠I-Ad αβ链RFP融合双顺反子表达载体的构建及其在COS-7中的表达

构建了在β链C端融合红色荧光蛋白(RFP)标签的BALB/c小鼠I-Adαβ链真核双顺反子表达载体pRed-IRES-I-Ad,使用LipofectAMINE2000转染COS-7细胞,用激光共聚焦显微镜观察外源蛋白在细胞中的表达与定位.I-Adαβ分子在COS-7细胞中能够以较高的效率表达,并且在COS细胞中能形成聚集状态.与通常的真核翻译帽子结构起始相比,IRES启动真核翻译系统的效率低于前者;与空质粒对比,IRES介导的真核翻译起始,RFP的表达量较低.