嗜麦芽假单胞菌hCG结合蛋白抗体制备及其特性研究

用纯化的嗜麦芽假单胞菌（以下简称细菌）ｈＣＧ结合蛋白制备多克隆抗体。间接免疫沉淀实验证明,该抗体能识别细菌ｈＣＧ结合蛋白－［（１２５）~Ⅰ］ｈＣＧ复合物;配体印迹分析及免疫印迹分析发现,该蛋白能与［（１２５）~Ⅰ］ｈＣＧ发生特异的结合,其结合位置与抗体识别位置一致,为７０ｋＤ蛋白带;同时,该抗体不能特异地抑制细菌ｈＣＧ结合蛋白、大鼠睾丸或卵巢组织细胞膜制剂与［（１２５）~Ⅰ］ｈＣＧ结合。     

睾丸特异抗原C_2B细胞抗原决定簇的定位

免疫性不育病人的血清（ＩＰＳ）能１００％地抑制人体外受精．用该血清筛选人睾丸ｃＤＮＡ基因表达文库,发现了一种新的睾丸特异抗原（称作Ｃ２）．通过ＤＮＡ顺序研究,并与基因库中的有关同源性基因数据进行比较,证实Ｃ２是一个新的特异蛋白．Ｃ２基因仅与睾丸组织的ｍＲＮＡ杂交．该克隆在大肠杆菌中所表达的融合蛋白能够被３个不同的不育病人血清识别．利用嵌套缺失和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹的方法研究其抗原决定簇定位,发现Ｂ细胞抗原决定簇在羧基端２９个氨基酸范围内．用ＧＣＧ软件分析该抗原的氨基酸的亲水性和疏水性以及其存在于蛋白表面的可能性,确定其中的１５个氨基酸为抗原决定簇所必需,并合成了多肽     

高活性重组hG-CSF的制备

我们构建了新的硫氧还蛋白（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）融合表达载体ｐＥＴＴｒｘＬ和ｐＥＴＴｒｘ－ＨｉｓＬ,它们可使功能蛋白在大肠杆菌胞质中以可溶性形式高效表达。利用此表达系统成功地获得的ｈＧ－ＣＳＦ－硫氧还蛋白融合蛋白的高效可溶性表达,表达水平达总细胞可溶蛋白的４１％以上。所表达的ｈＧ－ＣＳＦ－硫氧还蛋白融合蛋白可通过Ｃｕ２＋－ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ固相金属螯合层析柱,方便地从细胞破碎可溶上清中直接纯化。所获得的融合蛋白具有ｈＧ－ＣＳＦ特异的生物活性,其比活性达到０．５－１．３３×１０７ｕ／ｍｇ融合蛋白。这样表达的ｈＧ－ＣＳＦ融合蛋白能被ＩｇＡ蛋白酶特异地切割,将ｈＧ－ＣＳＦ从融合蛋白上切下获得与天然蛋白一级结构完全一致的重组ｈＧ－ＣＳＦ 。     

水稻谷氨酰胺合成酶同工酶免疫学性质比较研究

用纯化的水后（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）根部存在的两种谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）同工酶ＧＳｒａ和ＣＳｒｂ分别免疫兔子,得到相应的抗体。免疫扩散和免疫印迹实验表明,ＣＳｒａ、ＧＳｒｂ的抗体对ＧＳ及其同工酶是的。免疫沉淀试验表明,ＧＳｒａ、ＧＳｒｂ不仅识别它的相应的抗原,而且也能很好地识别彼此的抗原。这两种抗体也能较好地识别水稻叶片胞液型的ＧＳＴ,但对水稻叶片和菠菜（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅ     

水稻类受体激酶OsCR4的抗体制备及特异性检测

运用生物信息学的方法对水稻类受体激酶OsCR4的抗原性进行分析,选取胞外部分片段与GST融合,在细菌大规模诱导该融合蛋白,利用GST sepharose进行亲和层析纯化,所得蛋白使用SDS-PAGE结合KCl/DTT染色切胶的方法得到收集。以此融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔,获得了1：512,000效价的多克隆抗体,该抗体可特异识别水稻叶片微粒体组分中的OsCR4蛋白。     

一种可识别神经元特异微管蛋白的抗体

通过人工合成大鼠巢蛋白Ｃ－末端的一段２０肽,制备得到了抗巢蛋白的抗体－Ａｎｔｉ－Ｎｅｓ－２。我们发现该抗体除了能识别小鼠２４０ｋＤ的巢蛋白条带外,还特异性识别另一分子量约为５０ｋＤ的蛋白条带,蛋白印迹反应提示,该５０ｋＤ蛋白可能与神经细胞的增殖和分化相关。经分离纯化和Ｎ－端氨基酸序隐测定证实：该５０ｋＤ蛋白为微管蛋白。     

羧端部分缺失的HCV核心蛋白的融合表达,免疫原性及其应用

构建了丙型肝炎病毒核心蛋白的全长及Ｎ端和Ｎ端与谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）的融合表达克隆,比较了在不同大肠杆菌中的表达。表达蛋白为水溶性,经ＥＬＩＳＡ和蛋白质印迹分析,ＧＳＴＣ１９１的表达和稳定性都较差,ＧＳＴＣ６９和ＧＳＴＣ４０具有良好的稳定性,用ＧＳＴ亲和柱一步纯化,纯度可达９０％,免疫小鼠可产生高滴度的抗体。应用表达的ＧＳＴＣ６９和ＧＳＴＣ４０抗原,检测人血清中的ＨＣＶ核心蛋白抗体,初步结果     

小细胞肺癌肿瘤抗原相关基因的克隆

用肿瘤抗原特异的单抗２Ｆ７筛选人小细胞２肺癌细胞株ＮＣＩ－Ｈ１２８ｃＤＮＡ 士对其中Ｎｏ．４阳性克隆进一步研究。该克隆的溶源菌经４２℃ＩＰＴＧ诱导产生１６５ＫＤ的融合蛋白。它能同时被单抗２Ｆ７和抗－β－半乳糖苷酶抗体识别。     

抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融 …

将抗癌胚抗原单链抗体基因与核心链霉亲和素基因融合插入昆虫杆状病毒供体质粒ｐＦａｓｔＢａｃＨＴａ中,在粉纹夜蛾Ｔｎ－５Ｂ１－４细胞中进行表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,表达产物分子量为４１ｋＤ左右,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析结果表明,以ＨＲＰ标记的生物素进行蛋白质印迹在４１ｋＤ处可见表达条带,表明融合蛋白能特异性的与生物素结合,放射免疫分析表明重组杆状病毒表达产生的ＳｃＦｖ－ＣＳ蛋白能特异性结合癌胚     

非洲爪蟾PAPC多克隆抗体的制备及其特异性鉴定

非洲爪蟾ParaxialProtocadherin(PAPC)是一个在爪蟾Spemann组织者特异表达的膜蛋白.它在爪蟾原肠运动阶段的汇聚延伸运动和体节发生阶段的体节边界形成,以及早期听泡的形态发生和细胞特化过程中都有重要的作用.为了研究PAPC基因在早期胚胎发育过程中的表达及其生物学功能,需要制备PAPC抗体.应用谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneStransferase,GST)表达系统表达GST-PAPC融合蛋白,亲和纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得PAPC多克隆抗体.免疫印迹分析发现,以1∶3000稀释的该多克隆抗体为一抗时,能够在转染了全长PAPC质粒的HEK293T细胞的蛋白质抽提物中,特异地识别出150ku的印迹条带.同时,GST-PAPC融合蛋白可以竞争性抑制该抗体对全长PAPC质粒转染细胞的蛋白质抽提物的特异性条带.用1∶500稀释的该抗体为一抗进行免疫荧光分析时,发现,PAPC多克隆抗体能够识别在HEK293T细胞中过表达以及爪蟾动物极细胞中过表达的PAPC蛋白,荧光信号定位在细胞膜上.免疫印迹分析证明,PAPC抗体能够识别爪蟾胚胎中内源表达的PAPC蛋白.     

大鼠睾丸黄体生成素受体剪切变异体cDNA在昆虫细胞中的高效表达

研究了大鼠睾丸黄体生成素受体剪切变异体ｃＤＮＡ在昆虫细胞中的表达,并对其产物性质作了初步鉴定。ＳＤＳＰＡＧＥ银染和免疫印迹结果显示,表达产物呈两条带,分子量为３８.５ｋＤａ的主带和分子量为４０ｋＤａ的次带。^１２５Ｉ.ｈＣＧ结合印迹分析表明,表达产物Ｒ３１６具有与配基专一性结合的生物活力。竞争性配基结合曲线和Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析结果显示,重组受体Ｒ３１６和配基ｈＣＧ有较高的亲和力,平衡解离常数Ｋｄ为８.１５×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ。表达产物为与膜结合的蛋白,在条件培养基中未检测到它的存在     

拟南芥STN7和STN8蛋白激酶的结构预测和功能分析

STN7和STN8蛋白激酶分别参与了LHCⅡ蛋白和PSⅡ核心蛋白的磷酸化.作者用折叠识别的方法建立了拟南芥蛋白激酶STN7和STN8核心结构域的三维结构,同时结合其他生物信息学方法对STN7和STN8蛋白的结构和作用机制进行了探讨,选择特异位点合成多肽,并制备抗体.结果表明STN7和STN8蛋白激酶活性区域的电荷和形状互补性决定了两者作用底物蛋白的差异,蛋白印迹结果显示分别制备得到了STN7特异抗体和STN8特异抗体,证实结构预测的正确.     

用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选的Western印迹-SELEX筛选技术的建立

目的:建立一种基于Western印迹的指数式富集的配体系统进化(SELEX)技术,用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。方法:将目的蛋白经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上,用生物素标记的ss DNA与PVDF膜上的蛋白共同孵育,获得能与靶蛋白特异结合的适配体,最后通过生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统、基因克隆测序、MEME在线软件和RNAstructure软件分析适配体的一、二级结构,并对筛选得到的适配体进行鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了能特异识别靶蛋白而不识别无关蛋白的适配体,原库Gp45则与上述蛋白均没有结合。结论:建立了Western印迹-SELEX技术,可用于未纯化蛋白样品核酸适配体筛选。     

DNA损伤检查点蛋白调节子1片段的表达纯化及抗体制备

目的：原核表达、纯化DNA损伤检查点蛋白调节子1（MDC1）片段,并制备其多克隆抗体。方法：设计特异引物,通过RT-PCR扩增编码MDC1 N端194个氨基酸残基的基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果：原核表达并纯化了MDC1 N端片段,并获得了抗MDC1的多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹显示该抗血清能特异识别原核及真核细胞表达的MDC1。结论：MDC1 N端片段能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MDC1在Fhit特异信号通路中的作用奠定了基础。     

鸡胚骨骼肌组织M-CAT结合因子的初步鉴定

采用偶联ＣＡＴＴＧＣＴ寡核苷酸的ＤＮＡ亲和层析柱从发育１３ｄ鸡胚骨骼肌核抽提物中分离到两种核蛋白．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明,被ＤＮＡ亲和柱滞留的两种核蛋白分子量分别为３０ｋＤ和３２ｋＤ．凝胶阻滞结合竞争分析显示,纯化的核蛋白可与Ｍ－ＣＡＴ共有序列ＣＡＴＴＣＣＴ特异结合．Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术确定仅３０ｋＤ分子可直接识别、结合ＣＡＴＴＣＣＴ元件,但３２ｋＤ分子却不能．结果提示,３０ｋＤ分子为依赖ＤＮＡ的Ｍ－ＣＡＴ结合因子,３２ｋＤ分子属性有待进一步研究证实     

人粒细胞集落刺激因子hG—CSF cDNA在大肠杆菌中表…

在不改变编码蛋白质氨基酸序列的前提下,利用合成ＤＮＡ接头的方法,在原始ｃＤＮＡ克隆基础上,构建了５＇端密码子富含ＡＴ的ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ突变体,使ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ得以在大肠杆菌中表达,但表达水平很低,借助相同的手段,在ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ ５＇端增加２４核苷酸对的ＦＬＡＧ肽编码序列,构建了ｈＧ－ＣＳＦ杂合蛋白（在ｈＧ－ＣＳＦ成熟蛋白Ｎ末端增加８氨基酸残基ＦＬＡＧ肽,二者结合点为肠激肽酶     

S(yp) Y279和Y304介导了BcrAbl与Grb2等蛋白的结合

利用体外定点突变技术获得Ｓｙｐ Ｙ２７９Ｆ、Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ突变的ｃＤＮＡ, 将这些突变体和野生型Ｓｙｐ 分别构建入ｐＸＭ 真核表达载体, 转入Ｋ５６２ 细胞。经Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹证明, 各转染Ｋ５６２ 细胞中都有Ｓｙｐ 蛋白的表达。免疫沉淀与免疫印迹结果发现ＷＴ、Ｙ２７９Ｆ、Ｙ３０４Ｆ和Ｙ５４６Ｆ等４ 种Ｓｙｐ 在胞内均能直接与ＢｃｒＡｂｌ 结合。体外结合实验结果表明Ｙ３０４Ｆ突变导致了Ｓｙｐ 不能与Ｓｈｃ 结合,Ｙ２７９Ｆ突变则导致了Ｓｙｐ 不能与Ｇｒｂ２ 结合。结论是： 作为“接头蛋白”,Ｓｙｐ 可以介导ＢｃｒＡｂｌ 与Ｓｈｃ 和Ｇｒｂ２ 之间的结合;Ｇｒｂ２ 结合在Ｓｙｐ 的Ｙ２７９ 上,Ｓｈｃ 则结合在Ｓｙｐ的Ｙ３０４ 上     

大鼠卵巢绒毛膜促性腺激素受体在CHO中的表达和扩增

本文报道了利用二氢叶酸还原酶放大系统将大鼠ＬＨ／ｈＣＧ受体（记为Ｆ－ｈＣＧＲ）及其胞外肽段（记为Ｔ－ｈＣＧＲ）在中国苍鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中的表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,Ｆ－ｈＣＧＲ为一条蛋白质带,其表观分子量为９２ｋｄ,而Ｔ－ｈＣＧＲ为３５ｋｄ和３７ｋｄ两条带。表达受体对其配基ｈＣＧ表现出高的亲合力,Ｆ－ｈＣＧＲ的解离常数为７×１０－９ｍｏｌ／Ｌ,Ｔ－ｈＣＧＲ为６．４×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞可结合１２５Ｉ－ｈＣＧ,而表达Ｔ－ｈＣＧＢ者不结合１２５Ｉ－ｈＣＧ。这提示Ｆ－ｈＣＧＲ主要存在于细胞质膜表面上。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞能刺激。ｃＡＭＰ的形成,而表达Ｔ－ｈＣＧＲ者不能刺激ｃＡＭＰ形成。免疫荧光定位结果表明,Ｔ－ｈＣＧＲ主要分布于质膜的细胞质侧以及胞内其他一些细胞器膜上。用免疫亲和层析可以得到纯化的Ｔ－ｈＣＧＲ。     

基于分子印迹技术的细菌传感检测

分子印迹因其材料结构的稳定性及靶标物识别的特异性而被广泛应用于生化分离分析的相关领域。近年来，将具有选择性捕获、分离和富集靶标物等优势的分子印迹技术与生化传感检测技术有机结合，是目前细菌等微生物高效检测领域备受关注的研究热点。本文就分子印迹技术在细菌分析中的印迹方法、分析检测技术和典型应用等方面的最新进展进行综述。首先介绍了细菌分子印迹原理，对表面印迹的材料以及直接压印、间接印迹和电聚合等制备方法进行了总结和归纳；重点对基于荧光、电化学、石英晶体微天平（QCM）等检测模式的细菌印迹传感监测在细菌分析检测及其与微流控芯片技术耦合的应用和进展进行了综述；最后，提出了存在的挑战及发展的趋势。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)融合蛋白的高效表达及鉴定

碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）参与了许多细胞生长和分化的调控过程。本文采用重组ＤＮＡ技术在大肠杆菌中高效表达了人ｂＦＧＦ。首先将编码人ｂＦＧＦ基因克隆到ｐＸＴ表达载体中与其上游的一短Ｓ导肽共一阅读框架,ｂＦＧＦ基因的表达受强的Ｔ７启动子调控。采用ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌作为宿主菌,用ＩＰＴＧ诱导ＢＬ２１（ＤＥ３）细菌合成的Ｔ７ＲＮＡ聚合酶,后者可催化高水平的ｂＦＧＦ基因表达,其ｂＦＧＦ产量可占总菌体蛋白的４２.５％。采用肝素Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ一步亲和层析法直接从诱导后的细菌裂解产物中得到纯化的重组人ｂＦＧＦ蛋白。经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析证明该蛋白可被人ｂＦＧＦ特异性单克隆抗体所识别。进一步研究证明该蛋白具有刺激ＮＲ６Ｒ－３Ｔ３成纤维细胞增殖的生物学活性,并且这一活性可被人ｂＦＧＦ特异性中和抗体所中和。